FRET 荧光共振能量转移

3、供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、 子的吸收态偶极矩、以及它们的向量 必须满足一定的条件
FRET的应用 的应用
通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。 常用于解决如下问题: 1)蛋白分子的共定位; 2)蛋白分子聚合体; 3)转录机制; 4)转换途径; 5)分子运动; 6)蛋白折叠等生物学问题.
思考题
1. 为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非 常灵敏?
2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。
3. A和B分子都不能发射荧光,要求采用FRET技术检 测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理?
论文题目： 供体受体对之间R0定量分析与计算
FRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位
Laser
Laser
D A
荧光标记
利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略
FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用
Laser
FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化
Laser
FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量
(b)
Em. 535nm
Acceptor
Ex. 440nm
FRET 原理(Principle)
FRET的条件
发生FRET需要三个条件： 发生FRET需要三个条件： FRET需要三个条件 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收
光谱必须有显著的重迭， 30％； 光谱必须有显著的重迭，一般大于 30％； 2、供体分子和受体分子间的距离必须在 之间. D和 间的FRET 效率： 1 – 10 nm 之间. D和A间的FRET 效率：
2. 荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以 荧光（ ：
光的形式释放能量，这种光称为荧光。
3. 磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。 磷光（ ） 4. 激发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱（Spectra):
荧光共振能量转移
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
陈 同 生 华南师范大学信息光电子科技学院
分子能级与荧光
1. 能级（ Energy Level）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。 能级（ ）：
包含电子能级、振动能级和转动。
S1 hν0 hν1 hν2 S0 T1
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体 供体(Donor, D) 2. 受体 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光 现象的特征: 现象的特征
Em. 470nm
Donor
CFP
YFP Ex. 470nm
Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887
在FRET实验中经常使用的 供体-受体荧光分子对
1.染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5 BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED
2. 绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)
参考阅读文献
1. Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899–909 2. Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395 3. Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633 4. Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002 5. Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611 6.源自文库Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
6 R0 E= 6 R0 + R 6
D Em
A Ex
450
500
550
600
λ (nm)
R0: E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定 的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏.
举例: 假设 R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5% 2） R=5nm, E=50% 3） R=6nm, E=25%