2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤

作者：空青山

作品编号：89964445889663Gd53022257782215002

时间：2020.12.13

稳转慢病毒

一、所需试剂

1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）

（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分

（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分

（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.

三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。

2、包装细胞：293T细胞

3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒

4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物

5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌

**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml

6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）

7、无血清培养基：optimen

8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）

9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞

二、具体步骤

<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）

第一天

1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜

2、配制5X PEG8000/NaCl溶液

称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃

第二天

2、加入2ml全培养基DMEM

3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

第四天第五天：

1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）

2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞

3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次

4、4℃过夜

第六天

1、4℃，3500rpm，20min

2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体

3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶

4、50μl分装，-80℃保存。

<二>慢病毒转染靶细胞

1、第一天：准备96孔板，每孔加入10000个293T，为每个病毒准备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

2、第二天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入207µl培养液，往第一个管中加入23µl病毒原液，混匀后，吸取23µl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

3、第三天：换液

4、第四天：观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X孔的病毒液的含量（µl ）×1000。（前面算出的是没μl病毒量，所以乘于1000）

作者：空青山

作品编号：89964445889663Gd53022257782215002

时间：2020.12.13

第一天：

第二天

1、准备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解

2、准备完全培养基和Polybrene 混合物（1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10μg/ml之间），加入相应培养板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）

3、加入浓缩病毒液（12孔板30μl-50μl）（如果是直接购买病毒液需根据MOI确定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）

4、培养过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液

第三天

1、对细胞进行换液

第五天

1、用药物进行稳定株的筛选（具体筛选药物根据载体内的基因定，用氨苄青霉素0.5μg/ml-10μg/ml）

2、需设置空白对照（未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对照全部死光为筛选周期）第六天之后（根据筛选周期）

1、换液传代

2、观察GFP报告基因确定转染效率，或用qRT-PCR确定转染效率

三、注意事项及知识点

1、名词解释

（1）病毒感染复数（multiplicity of infection MOI）：含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染

2、慢病毒摸索时加入梯度（具体见自己的说明书）

3、慢病毒的储存与稀释:

可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）

A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度

B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中按照每次的使用量进行分装。

4、慢病毒载体示意图

《1》载体质粒（PLKO.1 抑制载体，PCDH-GFP+puro过表达载体）：

（1）5’LTR：long terminal repeat即长末端重复序列，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件

（2）包组信号ψ：LTR-ψ通过包装细胞的RNA聚合酶转录为RNA，通过ψ信号起始包装（3）启动子、酶切位点和抗性基因（amp氨苄青霉素puro嘌呤霉素）

（4）stuffer：目的基因插入位点（慢病毒载体可插入5kbp左右）

（5）GFP：green fluorescent protein绿色荧光蛋白

（6）WPRE：Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element 肝炎病毒转录后调控元件。转录后可形成三级结构，促进基因的表达

（7）cPPT/CTS:逆转录病毒顺式作用区域,其中该cPPT和CTS区域诱导三链ＤＮＡ结构