第八章_发酵过程参数的检测及控制

2、辅助检查方法
– 溶解氧
– pH值
– 尾气中CO2含量
（二）发酵过程染菌原因的分析
• 发酵染菌的主要原因
– 仪器设备的渗漏 – 仪器、设备、管道、管件存在死角 – 操作不当
•预防为主，“防重于治”
（１）国外一抗生素发酵染wenku.baidu.com原因的分析 染菌原因 种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 百分率，% 9.64 0.19 0.79 19.96 染菌原因 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 百分率，% 5.89 0.39 1.45 1.54
主要参数检测原理及仪器
• 溶氧的检测
1、常用检测方法：溶氧电极法
思考：溶氧电极如何标定？
2、电极的标定
一般测定中应进行以下二点标定 （1）零点标定 用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入 该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降 稳定后，调节零点旋钮显示零值。 （2）饱和校正（满刻度） 进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电 极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上 可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至 100%即为饱和值。
分析
• 个别发酵罐偶然染菌→原因比较复杂
（４）从染菌的时间来分析
• 发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设 备或管道有死角 • 中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理
（５）从染菌的类型来分析
• 耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底 • 球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的 • 浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗 漏 • 霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格
M 1
2 TC
• 控温方式：简单的On-Off （通-断）控制或PID控制。
5
冷却水
• 生产罐：冷、热水间接冷却
或加热（过夹套或盘管）。
空气 4
3
问题：一般10 m3以下发酵罐用夹套， 10 m3以上用盘管，为什么？
图7-18 发酵过程温度控制 1-温度传感变送器 2-温度控制器 3-调节阀 4-生化反映器 5-夹套
生长阶段
生成阶段
自溶阶段
2、引起pH下降的因素
碳源过量 消泡油添加过量 生理酸性物质的存在
3、引起pH上升的因素
氮源过多
生理碱性物质的存在 中间补料，碱性物质添加过多
4、 pH的控制
调节基础培养基的配方
调节碳氮比（C/N）
添加缓冲剂 补料控制 – 直接加酸加碱 – 补加碳源或氮源
第八章 发酵过程的监测与控制
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛。
一、发酵过程检测的主要参数
按性质分
1. 物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、 溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等 2. 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、 产物浓度、核酸量等 3. 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、 呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
！！！！
• 根据经验控制；
• 以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间 接控制流加； • 用传感器直接测定限制性基质的浓度， 直接控制流加； • ……
R
R：各控制参数
• pH
• DO
CO2
O2 M
2 G c 3
2
排气
1
pH
补料 冷却水
• 预设补料速率
• ……
DO
空气 图7-21 补料控制原理图 1-流量测量及变送 2-流量控制器 3-调节阀
主要参数检测原理及仪器
• 生物量的测定
• 干（湿）重法 • 压缩体积法（离心）
• 光密度测定法 OD600~660
• 其它方法（测粘度、静置沉降体积法）
问题：请问以上几种方法的适用范围？
主要参数检测原理及仪器
• 产物量的测定
• 比色法
• 利用HPLC检测
• 生物法（杯碟法）
•……
主要参数检测原理及仪器
生物传感器 ( Biosensor)
传感器：能感受 (或响应 )一种信息并变换成可测
量信号(一般指电学量)的器件。
生物传感器：将生物体的成份（酶、抗原、抗
体、激素）或生物体本身（细胞、细胞器、组织）
固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称为生物 传感器。
生物传感器的基本组成
组成：敏感元件（分子识别元件）和信号转换器件
1、基本的自动控制系统
②反馈控制 反馈控制是自动控制的主要方式
控制器
被控对象
传感器
1、基本的自动控制系统
②反馈控制
开关控制：控制阀门的全开全关；
PID控制：采用比例、积分、微分控制算法；
串联反馈控制：
两个以上控制器对一变量实施联合控制；
前馈/反馈控制：
前馈控制与反馈控制相结合。
1、基本的自动控制系统
• 死角是指灭菌时因某些原因使灭菌
温度达不到或不易达到的局部地区。
（1）法兰连接的死角
（２）渣滓在罐底与用环式空气分布管所形 成的死角
（３）不锈钢衬里的死角
（４）接种管路的死角 • 如下图a所示有一小段管路存在蒸汽不流
通的死角
• 解决办法：装设旁通（小放气阀）
（５）排气管的死角
（6）压力表安装不合理形成的死角
主要参数检测原理及仪器
•液体和气体流量测定
主要参数检测原理及仪器
• 搅拌转速
常用检测方法：磁感应式、光感应式和测速发电机等。
感应片切割磁 场或光速。
输出电压与转 速成正比。
主要参数检测原理及仪器
• pH的检测
常用pH检定仪为复合pH电极，具有
结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。
思考：pH电极如何标定？
原因不明
35.00
（３）从染菌的规模来分析染菌原因
• 大批发酵罐染菌 →空气系统 • 部分发酵罐(或罐组)染菌
？
分析
– 前期→种子带杂菌，或灭菌不彻底 – 中后期→中间补料系统或管路系统发生问题
• 个别发酵罐连续染菌
– 设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损) – 设备的腐蚀磨损（出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象）
搅拌轴密封泄漏 泡沫冒顶
夹套穿孔
2.09 0.48
12.36
其他设备漏 操作问题
原因不明
10.13 10.15
24.91
（２）国内一制药厂发酵染菌原因的分析
染菌原因 外界带入杂菌（取样、补料带入） 设备穿孔 空气系统带菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不够或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 百分率，% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.09 1.60 0.60
（二）pH的控制
• 一般PID控制 • 碳、氮源影响pH值 • pH下降——加碱（常用氨 水） • pH上升——需要对培养基
4 氨气 空气 图7-19 pH控制系统 1-测量电极和变送器 2-控制器 3-空气开关 4-气动开关阀门 空气 3 AC 2 1 冷却水
M
进行调整
1、发酵过程中pH的变化
• 糖的测定
• 斐林试剂法 • DNS法
• 苯酚硫酸法
• 氨氮的测定
• 凯氏定氮法 • 格利氏法
生物发酵溶液中营养成分与产物的分析
类别 检测物质 营养基质
微生物 细胞
发酵液待检测的物质成分 葡萄糖、麦芽糖、乳糖、醋酸、BOD等
产物及副产物
乙醇、氨、蛋白质、抗生素、氨基酸、有机酸、酶、 CH4、氢等 葡萄糖、氨基酸等 维生素、激素、抗生素
从检测手段分
1. 直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的
参数，如温度、pH、残糖等
①在线检测参数：不经取样直接从发酵罐上安装的仪表 上 得到的参数，如温度、pH、搅拌转速； ②离线检测参数：取出样后测定得到的参数，如残糖、 NH2-N、菌体浓度。
2. 间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如
糖类、醋酸、硝酸盐、氨基酸等 维生素、植物激素（2,4-D、NAA、6-BA等）
营养盐生长因子 无机盐(K+、Ca2+、NH+、NO3-等)、生物素、维生素
营养基质
动物 细胞
产物及副产物 蛋白质类（t-PA、GCSF、EPO、INF等)、乳酸、氨
生长因子
营养基质
植物 细胞
产物及副产物 次生代谢产物（植物色素、皂甙等）、氨、CO2 生长素
四、发酵染菌的危害与防止
• 所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵
入了有碍生产的其他微生物。
• 防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项
重要工作内容。
（一）发酵过程中染菌的检查判断
１、生产上常用杂菌检查方法
– 镜检（简便快速，早期染菌不易检出) – 平板划线 – 酚红肉汤培养
能检出更少杂菌，结果更准确 需时较长，操作较繁琐
（三）溶氧控制
• 通气量 • 搅拌速度 • 培养基组成
M
3
Gc2
5
4
• 补料方式及速率
• 富氧空气 • 反应器型式
空气 6
1
2
Gc1
7 8
溶解氧 控制器 GCDO
• 罐压
图7-20 溶解氧控制系统
• ……
1-溶解氧电极和变送器 2-溶解氧控制器 3-压力传感变送器 4-压力控制器 5-压力调节阀 6-空气流量变送器 7-流量控制器 8-流量调节阀
挥发性 物质检测
主要参数检测原理及仪器
• 温度的测定
热电阻、热电偶、半导体热敏电阻、玻璃温度计
一般出厂就已经校正好。
主要参数检测原理及仪器
• 罐压的测定
隔膜式压力表
问题：为什 么连接管为 直管而不是 弯管以保护 压力表？
主要参数检测原理及仪器
• 液位和泡沫高度的检测
液面或泡沫上升与电极 探针接触产生电信号。
摄氧率、KLa等
二、发酵过程参数常用检测方法及仪器
主要参数检测原理及仪器
• 取样系统
生物反应过程大多为纯培养，无菌操作十分重要。 问题 1. 三角瓶内的培养液如何取样？ 2. 发酵罐常用取样方式可否知道？
蒸 汽
发酵清液
不能取菌体
连续在线无菌取样
微孔陶瓷管
渗透膜管
问题： 检测 所得 产物 浓度 为发 酵液 中产 物浓 度吗？
生物传感器的分类
思考题
• 以上参数哪些是物理参数？哪些是化学参数？哪
些是生物参数？ • 以上参数哪些是直接参数？哪些是间接参数？ • 以上参数哪些是在线检测参数？哪些是离线检测 参数？
• 发酵工业中哪些参数的测定频率最高？
三、发酵过程的控制
• 主要控制温度、pH、溶氧浓度、基质浓度、泡沫等。
发酵过程的自动控制
（三）发酵染菌的防止
１. 种子带菌的原因及防止
• 带菌的原因
– 无菌室的无菌条件不符合要求、培养基灭菌 不彻底、操作不当。
• 种子带菌的防止
– 保持卫生 – 规范操作
２. 发酵设备、管件的渗漏与配置
• 设备和管件的微小漏孔。
• 试漏方法
– 气压试验
– 水压试验
阀门试漏的方法
３. 发酵罐与管件的死角
③自适应控制：
提取有关输入、输出信息，对模型和
参数不断进行辩识，使模型逐渐完善；同
时自动修改控制器的动作，适应实际过 程。——自适应控制系统。
2、发酵自动控制系统的硬件组成
传感器 变送器 执行机构
电磁阀、气动控制阀、电动调节阀、变速电机、 正位移泵、蠕动泵。
转换器 过程接口 监控计算机
（一）温度的控制
变量测量和变化规律的认识→控制器(自动化仪 表、计算机组成) →控制关键变量→控制发酵过程
1、基本的自动控制系统
①前馈控制
②反馈控制
③自适应控制
2、发酵自动控制系统的硬件组成
1、基本的自动控制系统
①前馈控制：
通过动态反应快的变量测量来预测反 应慢、易干扰的被控对象的变化，并提前 实施控制。 如：通过冷却水压力（控制阀）控制温度 变化。
（四）泡沫控制
1、 影响泡沫稳定的因素
• 通气与搅拌
• 培养基组成
• 培养液性质变化
• 灭菌
• 染菌
• ……
2、泡沫控制的方法
• 化学消泡——天然油脂、泡敌等。
• 机械消泡
– 罐内 – 罐外
• 其他方法
– 调节通风与搅拌、增大罐压、……
（五）补料控制
1、基质浓度对发酵的影响
抑制生长
饥饿
2、补料控制的策略