_HPLC-ELSD法测定前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱的方法改进

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34（ 7）
胆碱峰的保留时间 处 无 色 谱 峰，辅 料 不 干 扰 样 品 的测定。
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图 2 辅料干扰试验色谱图 Fig 2 Chromatogram of the excipients interference test A． 对照品（ reference substance） B． 样品 （ sample） C． 辅 料 （ adjuvant） 1． 溶血磷脂酰胆碱（ lysophosphatidycholine）
碱中的主要成分磷脂酰胆碱（ phosphatidylcholine， PC） 发生水 解，失 去 脂 肪 酸 后 生 成 的 杂 质［2］。如 果 其 浓 度 增 高，可 使 红 细 胞 膜 溶 解，可 以 诱 发 炎 症反应，增加氧化应激，干 扰 血 管 内 皮 功 能，破 坏 斑块稳定性［3］。按现行标准（ 国家食品药品监督 管理局标准 YBH01852009 ） 检 验 ，采 用 HPLC － ELSD 法 测 定 ，在 试 验 过 程 中 发 现 溶 血 磷 脂 酰 胆
4. 2 分离度考察试验 溶血磷脂酰胆碱为磷脂酰胆碱的降解产物，故
以溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱的混合溶液考察系 统的分离度。取磷脂酰胆碱对照品 20. 12 mg，加溶 剂正 庚 烷 － 异 丙 醇 （ 1 ∶ 2 ） 10 mL 溶 解，摇 匀，取 1 mL，加溶血磷脂酰胆碱对照品溶液 1 mL，混匀，进 样 5 μL。溶血磷脂酰胆碱与磷脂酰胆碱色谱峰能 够完全分开，色谱图见图 3。 4. 2 专属性考察 4. 2. 1 酸破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量瓶 中，加三氟乙酸 1 滴，摇匀，室温放置 30 min，加三乙 胺 1 滴，加 正 庚 烷 － 异 丙 醇 （ 1 ∶ 2 ） 至 刻 度，摇 匀， 即得。 4. 2. 2 碱破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量瓶
试药： 溶血磷脂酰胆碱对照品（ 来源： Sigma； 批 号： BCBD9043V； 纯度： 99. 0% ） ，磷脂酰胆碱对照品 （ 来 源： Doosan Corporation； 批 号： CP21010； 纯 度： 100. 0% ） ，正庚烷（ 来源： 天津市科密欧化学试剂有 限公司； 批号： 120762 － 5； 色谱纯） ，异丙醇（ 来源： 天津市四友精细化学品有限公司； 批号： 401302 － 02887； 色谱纯） ，三氟乙酸、三乙胺、过氧化氢均为 分析纯，水为超纯水。
表 1 梯度洗脱程序表 Tab 1 Gradient elution program
时间（ time） / min 0. 01 3. 00 3. 01 8. 00 8. 01
12. 00 12. 01 15. 00
流动相（ mobile phase）
A/%
B/%
25
75
50
50
100
0
100
0
0
100
WANG Quan － yi，JIAO Xiao － man
（ Institute for Drug Control of Liaoning Province，Shenyang 110023，China）
Abstract Objective： To develop a new method for lysophosphatidycholine （ LCP） determination of alprostadil injection． Methods： The assay was carried out on a Silica gel column （ dihydroxypropyl bonded silica as a filler） with the mobile phase of n － heptane － isopropanol － water（ 29. 5 ∶ 59 ∶ 11. 5 ） and n － heptane － isopropanol（ 43 ∶ 57 ） at a gradient with a flow rate of 1. 0 mL·min －1 ． The column temperature was 35 ℃ ． The drift tube temperature of the evaporative light scattering detector was 60 ℃ and the carrier gas flow rate was 3. 2 L·min － 1 ． Ｒesults： The linear range of lysophosphatidycholine was good between 0. 2 － 1. 8 μg（ r = 0. 9995 ） ，and the average recovery was 100. 2 % （ n = 9 ） ； the repeatability，specificity，stability of the test solution were good， and there was no interference among the components． Conclusion： The new HPLC method is good in the aspect of selectivity，sensitivity and accuracy，and can be used to replace the detection method for lysophosphatidycholine in alprostadil injection． Key words： alprostadil； lysophosphatidycholine（ LCP） ； impurity detection； HPLC； ELSD； gradient elution； standard improvement
2. 2 供试品溶液的制备 取 5 支前列地尔注射液内容物混匀，精密量取
1 mL，置 10 mL 量瓶中，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 稀 释至刻度，摇匀，即得。 3 色谱条件
采用硅胶柱（ Agilent LiChrosorb 5 Diol 250 mm × 4. 6 mm，二羟基丙基键合硅胶为填充剂） ，以正庚 烷 － 异丙醇 － 水（ 29. 5∶ 59 ∶ 11. 5） 为流动相 A，以正 庚烷 － 异丙醇（ 43∶ 57） 为流动相 B，进行梯度洗脱（ 见 表 1） ，流速 1. 0 mL·min －1 ，蒸发光散射检测器（ 飘移 管温度 60 ℃ ，载气流量 3. 2 L·min －1 ） ，柱温 35 ℃ 。
本文采用改进后的 HPLC － ELSD 法测定前列 地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱含量，采用梯度洗脱 的方法，将溶血磷脂酰胆碱与杂质完全分离，主成分 峰形理想，结果准确，能够有效地评价和控制制剂的 质量。 1 仪器与试药
仪器： Waters 2695 高 效 液 相 色 谱 仪，Waters 2420 蒸发光检测器。
在 0. 2 ～ 1. 8 μg（ r = 0. 9995） 范围内，线性关系良好； 平均回收率（ n = 9） 为 100. 2% ； 重复性、专属性、供试品溶液的稳定性良
好，辅料对测定无干扰。结论： 经方法学验证，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，可以作为替代前列地尔注射液中溶血磷
脂酰胆碱含量测定的方法。
前列地尔注射液是由前列地尔加大豆油及 蛋黄磷脂酰胆碱制 成 的 无 菌 乳 状 液，其 中 蛋 黄 磷 脂酰胆碱作为乳化剂。用于治疗慢性动脉闭塞 症，改 善 心 脑 血 管 微 循 环 障 碍，脏 器 移 植 术 后 抗 栓治疗，抑制移植血管 内 的 血 栓 形 成［1］。溶 血 磷 脂酰胆碱（ lysophosphatidycholine ，LPC） 为前列 地 尔注射液中已知杂 质，系 主 要 辅 料 蛋 黄 磷 脂 酰 胆
第一作者 Tel： 13386877070； E － mail： lnyjwqy@ sina． com
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碱 峰 为 双 肩 峰 ，系 由 现 行 等 度 洗 脱 方 法 无 法 对 溶血磷脂酰胆碱的主成分及结构类似物完全分 离 所 致 ，无 法 准 确 积 分 ，导 致 结 果 的 判 定 缺 少 可 信性。
样品： 某 企 业 提 供； 批 号： 20120510 （ 规 格： 2 mL ∶ 10 μg ） 、20120701 （ 规 格 2 mL ∶ 10 μg ） 、 20120701（ 规格 1 mL： 5 μg） 2 溶液的制备 2. 1 对照品溶液的制备
精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品 10. 10 mg，置 50 mL 量瓶中，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 溶解并稀释 至刻度，摇匀，即得。
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HPLC － ELSD 法测定前列地尔注射液中 溶血磷脂酰胆碱的方法改进
王全一，矫筱蔓
（ 辽宁省药品检验检测院，沈阳 110023）
摘要 目的： 建立前列地尔注射液中溶血磷脂酰胆碱含量测定的新方法。方法： 采用硅胶柱（ 二羟基丙基键合硅胶为填充
0
100
25
75
25
75
取对照品溶液，进样 5 μL，按原标准方法及本 方法依法测定，色谱图见图 1。由图 1 可见，改进后 的方法获得的色谱图峰形良好，可用于溶血磷脂酰 胆碱的定性、定量分析。
图 1 原标准方法（ A） 与改进方法（ B） 溶血磷脂酰胆碱色谱峰形比较图 Fig 1 Comparison diagram of lysophosphatidylcholine chromatographic peak by the original standard method （ A） and the improved method （ B） 1． 溶血磷脂酰胆碱（ lysophosphatidycholine）
剂） ，以正庚烷 － 异丙醇 － 水（ 29. 5∶ 59∶ 11. 5） 为流动相 A，以正庚烷 － 异丙醇（ 43 ∶ 57） 为流动相 B，进行梯度洗脱，流速为 1. 0 mL·min － 1 ，蒸发光散射检测器（ 飘移管温度 60 ℃ ，载气流量 3. 2 L·min － 1 ） ，柱温为 35 ℃ 。结果： 溶血磷脂酰胆碱进样量
图 3 分离度考察色谱图 Fig 3 The separation degree of chromatogram 1． 磷脂酰胆碱 （ phosphatidylcholine） 2． 溶血磷脂酰胆碱 （ lysophosphatidycholine）
中，加三乙胺 1 滴，摇匀，60 ℃ 水浴放置 2 h，放冷， 加三氟乙酸 1 滴，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 至刻度， 摇匀，即得。 4. 2. 3 氧化破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量 瓶中，加 30% 过氧化氢溶液 0. 1 mL，80 ℃ 水浴放置 5 h，放冷，加正庚烷 － 异丙醇（ 1 ∶ 2 ） 至刻度，摇匀， 即得。 4. 2. 4 高温破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 量 瓶中，110 ℃ 加热 3 h，放冷，加正庚烷 － 异丙醇（ 1∶ 2） 至刻度，摇匀，即得。 4. 2. 5 光照破坏溶液 取样品 1 mL，置 10 mL 透 明量瓶中，4500 lx 下照射 8 d，加正庚烷 － 异丙醇 （ 1∶ 2） 至刻度，摇匀，即得。
关键词： 前列地尔； 溶血磷脂酰胆碱； 杂质检测； 高效液相色谱； 蒸发光散射检测（ ELSD） ； 梯度洗脱； 标准改进
中图分类号： Ｒ917
文献标识码： A
文章编号： 0254 － 1793（ 2014） 07 － 1291 － 05
Method improvement of lysophosphatidylcholine determination of alprostadil injection by HPLC － ELSD
4 方法学考察及样品测定 4. 1 辅料干扰试验
按制剂 的 处 方 工 艺 制 得 不 含 磷 脂 酰 胆 碱 的
辅料溶液，取对 照 品 溶 液 5 μL、供 试 品 溶 液 及 辅 料溶液各 10 μL，依 法 进 样 测 定，色 谱 图 见 图 2 。 由图 2 可见，辅料在 对 照 品 及 样 品 中 溶 血 磷 脂 酰