细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育

细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育王学德 李悦有浙江大学农业与生物技术学院 杭州摘要 用根癌农杆菌介导法 将谷胱甘肽≥2转移酶基因(γστ)导入待改良的棉花细胞质雄性不育的恢复系中∀从转化植株的后代中筛选到一个对雄性不育系具有强恢复力的恢复系 暂记为/浙大强恢0∀/浙大强恢0与受体恢复系/⁄∞≥2 ƒ 0比较 对不育系的恢复力提高了 从而使杂种ƒ 单株结铃数多 个 不孕籽率降低了 皮棉产量提高了 ∀以基因γστ作为探针进行的≥ ∏ 和 核酸杂交分析表明 /浙大强恢0中含有外源基因γστ并有较高水平的表达∀关键词 陆地棉 细胞质雄性不育 转基因恢复系⁄ √ ×≤ ≥≤ • ÷∏ 2 ≠∏ 2 ∏(ΧολλεγεοφΑγριχυλτυρεανδΒιοτεχηνολογψ,ΖηεϕιανγΥνιϖερσιτψ,Ηανγζηου310029)∏ ≥2 ≥× ∏ ∏ Γοσσψπιυμηιρσυτυμ ∏ Αγροβαχτεριυμ2 2− . • −⁄∞≥2 ƒ . − . √ ≅ ƒ ∏ − .∏ −⁄∞≥2 ƒ . ≥ ∏ 2 γστ¬ − .≤ × 收稿日期 2 2基金项目 国家转基因植物研究与产业化专项基金 2 2 2 !教育部博士点专项基金浙江省自然科学基金 和重点科技项目基金作者简介 王学德 2 男 浙江上虞人 教授 博士 主要从事植物遗传学和育种学方面的研究∀× 2 ƒ ¬ 2∞2 ¬∏ ∏ 棉花具有十分明显的杂种优势≈但是棉花杂种种子的制种手段仍落后于玉米!水稻和油菜等作物∀其主要原因之一是在棉花中可利用的雄性不育类型尚不多∀虽然 世纪 年代美国育成具有哈克尼西棉细胞质的雄性不育系⁄∞≥2 ≥但由于它的恢复系⁄∞≥2 ƒ 的恢复力不够强 杂种ƒ 花粉粒活力较低 从而引起棉花结铃率低!不孕籽率高和产量低≈ ∗ ∀至今 哈克尼西棉细胞质雄性不育系统尚未在制种生产中应用∀为克服现有恢复系对不育系恢复力不够强的缺点 我们用根癌农杆菌介导法 将一个具有抗逆性能的谷胱甘肽≥转移酶 ∏ ≥2× ≥× 基因γστ 导入恢复系 从转化棉株后代中筛选到一个对不育系具有强恢复力的恢复系/浙大强恢0∀本文报道这个转基因恢复系的育成过程和主要特性 并对γστ基因可能的作用机理进行探讨∀中国农业科学≥ ∏ ∏ ≥1材料与方法1 1材料具有哈克尼西棉细胞质的雄性不育系 个 ⁄∞≥2 ≥ !中 和抗 恢复系 个 ⁄∞≥2 ƒ 和 2 2 ∀其中恢复系作为转基因的受体材料∀1 2基因的转化含基因γστ的根癌农杆菌菌系∞ 2 在含卡那霉素和庆大霉素的改良 液体培养基中繁殖后 离心沉淀 经无抗菌素的 培养基洗 次后 置 ε备用∀在棉花开花盛期 选取开花前 的花蕾 剥去部分花瓣 露出花药 用微量注射器将 Λ 左右的菌液小心注入每个花药 以感染花粉粒∀在开花当天上午 收集处理后的花粉粒授于受体恢复系的柱头上 挂纸牌以标记∀1 3转基因植株后代的选择从挂牌棉铃中收获的种子到海南岛繁殖加代 在开花期根据恢复系的花药形态及散粉程度 有选择地进行不育系与各恢复系 株行或单株 测交∀当年测交种子 ƒ 在杭州种植测定可育花粉率 根据ƒ 育性高低判别恢复系对不育系的恢复力强弱∀选择强恢复系自交 再去海南岛繁殖加代!选择和测交 如此循环 次 选定的恢复系在遗传上已稳定 并具有强恢复力 记为/浙大强恢0∀1 4转基因植株的分子检测1 4 1≥ ∏ 杂交以受体恢复系⁄∞≥2 ƒ 的⁄ 为对照 转基因恢复系/浙大强恢0⁄ 经∞ 完全消化后电泳分离 并转印于尼龙膜上 用地高辛标记的探针 基因γστ 与尼龙膜上的基因组⁄ 片段进行≥ ∏ 杂交!显影和照相∀1 4 2 杂交以受体恢复系花药的 为对照 转基因恢复系花药 在变性胶中电泳分离 并转印于尼龙膜上 用地高辛标记的探针 基因γστ 与尼龙膜上的 进行 杂交!显影和照相∀2结果与分析2 1/浙大强恢0的选育过程和对不育系的恢复力年夏在杭州 以美国恢复系⁄∞≥2 ƒ 和 2 2 的花粉为基因转化受体材料 用根癌农杆菌介导法 并通过花粉自然受精途径 将基因γστ分别导入到⁄∞≥2 ƒ 和 2 2 中 分子生物学证据详见下文 ∀因受体恢复系是纯系 自交繁殖 代以上 其转化当代植株的基因组只在外源基因位点是杂合的 转化后的个体经连续 代自交和选择 冬在海南三亚 年夏在杭州和冬在海南三亚 年夏在杭州 遗传上已趋于稳定∀根据花药大小及其散粉程度 从群体中严格选取花药大和散粉好的个体 并通过测交决选具强恢复力的单株 并综合农艺性状的表现 最终选取 个株系合并成一个恢复系 该材料对不育系具有强恢复力 记为/浙大强恢0∀以受体恢复系 2 2 和⁄∞≥2 ƒ 为对照 /浙大强恢0分别与 个不育系⁄∞≥2 ≥ !中 和抗 杂交 用甲萘酚2联苯胺染色法≈ 测定 个组合的ƒ 可育花粉率 统计杭州和海南两地 ∗ 数据 获平均值列于表 ∀从表中可看出 以/浙大强恢0为父本与不育系杂交 其ƒ 的可育花粉率达 比以 2 2 和⁄∞≥2 ƒ 为父本的ƒ 可育花粉率分别高 和 达显著和极显著水平∀从花器的表型 图 也可明显看出 抗 ≅浙大强恢 ƒ 比对照 抗 ≅ 2 2 ƒ 和 抗 ≅⁄∞≥2 ƒ ƒ 的花器要大 且花药大 花粉多 散粉好∀/浙大强恢0的恢复力比原 个受体恢复系有显著的提高 充分表明γστ基因对不育系的育性恢复有促进作用 也从表型上证实/浙大强恢0含有外源γστ基因∀表1/浙大强恢0与恢复系/0261322 0和/⁄∞≥2 ƒ2770在恢复力上的比较 杭州和三亚 ∗ 年× ≤ − .− 2 2 . −⁄∞≥2 ƒ . ∏≥ ∗恢复系对不育系的恢复力比≤ 和≤ 增√ ≤≤比≤ 增√ ≤浙大强恢 332 2 ≤ 3⁄∞≥2 ƒ ≤ 33中 常规良种≤≤不育系与恢复系杂交 ƒ的可育花粉率 3和33分别表示差异达 和 显著水平∀下同° √ ≅ ƒ 3 33 √ √ ×2 2用/浙大强恢0配制的杂种的产量年在海南三亚 用转基因恢复系/浙大强中国农业科学抗 ≅浙大强恢 ƒ 抗 ≅ 2 2 ƒ 抗 ≅⁄∞≥2 ƒ ƒ 抗≅ ƒ ≅ 2 2 ƒ ≅⁄∞≥2 ƒ ƒ图1/浙大强恢0对不育系 抗 的恢复力ƒ − .恢0配制的 个组合的杂种种子 年 月在浙江省 个县 市 布置 个点进行 次重复的比较试验 筛选出 个最好的三系杂交棉组合/浙杂 0 组合亲本为 抗 ≅浙大强恢∀从表 可见 /浙杂 0 个点平均皮棉产量为 比推广良种/泗棉 号0增产 其中金华 和兰溪 各有 个点增产达 和 ∀尤其 /浙杂 0在浦江点比/中杂 0 用人工去雄法制种 增产 ∀金华 点可能由于土壤肥力不均 使增产幅度与其它点偏差较大∀试验还表明 表 /浙杂 0单株结铃数比对照多 个 单铃重和衣分分别增加 特别是孕籽率显著地降低了 ∀由于/浙大强恢0对不育系具有强的育性恢复力 用它配制的杂种 ƒ 花粉育性得到极显著的提高 表 从而有利于结籽率和结铃性的提高 也间接地提高了单铃重∀纤维品质 除了比强度较差外 其它指标与对照无显著差异∀表2/浙杂1660 抗 ≅浙大强恢 的产量表现 年× ≠ − . ≅试验点∞¬ 组合 品种≤ ≤皮棉产量比≤ 增产√ ≤浦江浙杂 3°∏ 中杂 ≤兰溪 浙杂 3 ¬ 泗棉 号≥ ≤ 兰溪 浙杂 3 ¬ 泗棉 号≥ ≤ 金华 浙杂 33 ∏ 泗棉 号≥ ≤ 金华 浙杂 ∏ 泗棉 号≥ ≤ 各点平均 浙杂 32 3用/浙大强恢0制种的杂种种子产量年 在杭州华家池进行制种试验 在 制种田中 不育系与恢复系按 Β 间隔种植 在开花盛期 月 日 放置 箱土蜂辅助传粉 配适当的治虫等田间管理措施 制种技术另文报道 ∀在自然条件下 由于传粉媒介存在 不育系花柱能得到较丰富的恢复系的花粉 从而获得较高的制种产量∀如表 所示 从不育系上收获的种子 杂种ƒ 产量为 虽比恢复系种子减产 但未达显著水平∀不育系单铃重比恢复系要低 其原因是不育系不孕籽较多 比恢复系高 ∀2 4/浙大强恢0中外源基因的检测本研究所采用的根癌农杆菌重组菌株是∞ 2 是个二元载体系统 含 ≥启动子和终止子的基因γστ插在二元载体 ≤ 的×2⁄ 左右臂之间∀为检测/浙大强恢0外源基因γστ的存在和表达程度 用Ηινδ 酶切载体 低熔点琼脂糖凝胶电泳分离和回收基因γστ片段 该片段作为≥ ∏ 和 杂交的探针∀从≥ ∏ 杂交中可看出 图 转基因恢复系/浙大强恢0虽与它的受体恢复系/⁄∞≥2 ƒ 0相似 在基因组⁄ 中均含有与基因γστ同源的序列 但杂交信号所显示的谱带范围较宽 据报道谷胱甘肽≥转移酶 ∏ ≥2× ≥× 在植物基因组中是一个酶的异质家族 ∏ 2 由序列相似的多基因编码≈ ∀从而可以假期王学德等 细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育表3 与⁄∞≥2 ƒ277比较 /浙大强恢0对杂种 ƒ1 农艺性状的效应 金华× ∞ − .⁄∞≥2 ƒ ∏ 杂交组合≤株高° 单株果枝数∏ 单株结铃数单铃重衣分不孕籽率ƒ¬≥√ ∏ 抗 ≅浙大强恢≅抗 ≅⁄∞≥2 ƒ≅⁄∞≥2 ƒ ≤差值3由于对照不孕籽率高 衣分偏高∏表4 三系杂交棉的制种产量 杭州× ¬ ∏ 项目单株铃数单铃重不孕籽率子棉产量≤ 种子产量≥ 从不育系上收获从恢复系上收获差值3333设 转化受体 ⁄∞≥2 ƒ 的内源γστ基因序列在基因组中是多次重复的∀因此 当个别外源 序列随×2⁄ 整合在⁄∞≥2 ƒ 染色体后获得的转化体 浙大强恢 与非转化体 ⁄∞≥2 ƒ 间杂交信号的差异不明显∀然而 从 杂交中可看出 图 /浙大强恢0γστ的表达程度明显地高于⁄∞≥2图2 ≥ ∏ 杂交 1 探针 基因 与∞ 消化的/浙大强恢0 左 和/⁄∞≥2 ƒ2770 右 基因组⁄ 杂交以及 杂交 2 探针基因 与/浙大强恢0 左 和/⁄∞≥2 ƒ2770 右 花药的总 杂交ƒ ≥ ∏ ⁄∞ − . −⁄∞≥2 ƒ . γστ × − . −⁄∞≥2 ƒ . γστ ƒ 的表达∀基因γστ在转基因恢复系中的高效表达说明/浙大强恢0恢复力的提高与外源基因的高效表达相关也就证实了/浙大强恢0含有外源基因γστ这些都与表型检测是一致的 表 和图 ∀基因γστ在/浙大强恢0中的高效表达 是由于重组×2⁄ 整合到棉花基因组中引起还是由于外源基因γστ与棉花内源基因γστ的协同作用引起 虽然尚未清楚 但是γστ对/浙大强恢0细胞质不育基因补偿作用有提高 或对其核恢复基因表达有促进 均是可能的∀3 讨论我国利用水稻细胞质雄性不育和油菜细胞质雄性不育生产杂种种子已取得成功∀但是棉花杂种优势利用要比其它作物如玉米!水稻!油菜!高粱等相对落后∀这主要是因为棉花雄性不育在杂种优势中的利用存在两个问题一是 核基因控制的不育系 虽具有恢复系广和配组合容易的优点 但由于棉花中尚未找到一种具有育性转换特性 如对光或温敏感而实现育性转换 的核不育系 其不育不易保持即尚未找到真正意义上的保持系 二是 质核互作的细胞质雄性不育系虽保持系来源广 但恢复系的恢复力不够强而导致大量棉铃脱落 并带有不良中 国 农 业 科 学性状 如/裂根0和/矮生扭曲顶叶0≈ ∀在这种情形下 生产上为了利用棉花的杂种优势 在印度和中国等劳动力价格较低的国家 人们常采用/人工去雄授粉法0制种≈ ∀但是 这种原始的高成本的制种手段与现代的杂种优势利用是十分不相称的 而且这种不相称性将随着劳动力价格的提高显得愈来愈突出∀本研究针对哈克尼西棉细胞质雄性不育的/三系0中恢复系的恢复力不够强的缺点 用转基因技术将谷胱甘肽≥转移酶 ≥× 基因(γστ)导入到恢复系中 培育成了强恢复系/浙大强恢0∀并用传统育种方法也克服了原恢复系携带的/裂根0和/矮生扭曲顶叶0等不良性状∀由于/浙大强恢0对不育系育性的恢复力比美国恢复系⁄∞≥2 ƒ 提高了 使其杂种的结铃性提高和不孕籽率降低 从而促进了杂种产量优势的高效表达∀用该恢复系制种 在较多的传粉媒介条件下 每 不育系可收获杂种种子 左右 已基本达到杂种棉制种的要求∀转基因强恢复系的育成对于棉花杂种优势的大面积利用 以及促进棉花种子产业化进程具有重要意义∀但是 本研究离应用仍有一定差距 特别需要高强优势组合的选育∀谷胱甘肽≥转移酶 ≥× 的主要功能之一是提高植物细胞膜的修复能力 在基因工程中常被用来提高植物的抗逆性能≈ ∀植物细胞质雄性不育常与线粒体基因的突变有关 而线粒体基因突变常引起线粒体膜受损和功能的失常≈ ∀棉花不育系的线粒体基因也发生突变≈ ∀将γστ基因导入恢复系后 转基因恢复系与不育系杂交 其杂种ƒ 的育性恢复正常 具体表现为结铃多 不孕籽少 产量高∀这可能是因为γστ基因与恢复基因互作促进了线粒体功能的修复和花粉育性的提高∀虽然有关谷胱甘肽≥转移酶 ≥× 提高植物的抗逆性能和延缓细胞衰老已有较多报道≈ 但对于促进花粉育性的机理仍少见报道 值得进一步研究∀致谢 申宗坦教授提供部分试验材料 俞志华!蒋淑丽和朱云国等同志参加部分工作 谨致谢意∀≈ • ÷⁄ ≥ ∏ 2 2≥ ≤王学德 等 棉花亲本遗传距离与杂种优势间的相关性研究作物学报≈ • ÷⁄ ≤ ƒ 2 2 ∏ ≤ ≤≤王学德 陆地棉品种间杂种一代的产量结构特点 中国棉花≈ • ÷⁄ ≤ ∏ ≥≤王学德 等 细胞质雄性不育陆地棉的细胞质效应 作物学报≈ • ÷⁄ ≤ √ °⁄ ⁄ 2≥ ∏ ∏ ≥≤王学德 等 细胞质雄性不育棉花的小孢子发生的细胞学观察和线粒体⁄ 的 °⁄分析 中国农业科学≈ ≠∏ ≥ ∏ √ 2 2 ≥ ≤ 2俞志华 等 棉花细胞质雄性不育的研究及改良 棉花学报≈ • ÷⁄ 2 √ ∏≥ ∏ ∏ ≥≤王学德 等 棉花细胞质雄性不育系育性恢复的遗传基础恢复基因及其遗传效应 中国农业科学≈ • ÷⁄ 2 √ ∏≤ ∏≈ ° ≥ ≤ ∏ ° ƒ 2 ≤ ¬ ∏≈ ¬ ∂° √ ¬ ∏ ≥2 ∏ ¬∏ ∏≈ ° ∏ ∏ √≈ • ÷⁄ ⁄≥ ≤ ≥ ≤≈ • ÷⁄ ⁄ 2 ≥≤王学德 细胞质雄性不育棉花线粒体蛋白质和⁄ 的分析作物学报期王学德等 细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育。