3土壤线虫三种分离方法效率比较_毛小芳
线虫分离方法
线虫分离方法嘿，朋友们！今天咱们来聊聊线虫分离这事儿，就像在微观的魔法世界里玩一场特别的“捉妖记”，只不过我们要捉的是线虫这个小“妖精”。
你可别小看线虫啊，它们就像微观世界里的小泥鳅，滑溜溜的，要把它们从一堆东西里分离出来，那难度可不亚于从一碗芝麻里挑出特定的那几颗。
首先呢，有一种漏斗分离法。
想象一下，这个漏斗就是线虫的超级滑梯。
我们把含有线虫的土样或者其他样本放在漏斗上面的滤网上，就像把一堆小怪物关进了一个特殊的牢笼。
然后呢，在漏斗下面放上一个小容器，里面装点水，这就像是在滑梯下面放个小水潭等着接住掉下来的线虫。
线虫们啊，就像一个个调皮的小水鬼，慢慢从滤网的缝隙里滑落到下面的水里，这样就初步把它们和其他杂质分开啦，是不是很有趣呢？还有漂浮分离法。
这就像是在举办一场线虫的水上漂浮派对。
我们把样本放到一种特殊的溶液里，这种溶液就像是线虫的魔法泳池。
那些线虫啊，就像小气球一样，在这个魔法泳池里飘起来，而那些比较重的杂质就只能沉在水底，眼巴巴地看着线虫们在上面逍遥自在。
这时候，我们就可以轻松地把飘在上面的线虫捞起来啦，就像从派对上抓走那些最活跃的小嘉宾。
再说说离心分离法吧。
这个就像是让线虫们坐超级旋转木马。
把样本放进离心机这个大旋转器里，一转起来，线虫们就像被龙卷风卷起来一样，按照重量和密度不同被甩到不同的地方。
我们就可以在特定的区域找到线虫这个小旋风客啦，就像在旋转木马里找到特定的小木马一样。
有时候，我们还会用到手工挑取法。
这可就是考验眼力的超级大挑战啦。
就像在一堆沙子里找最最细小的钻石一样。
我们拿着特制的小工具，眼睛瞪得像铜铃，在显微镜下仔细搜索那些像小线头一样的线虫，然后小心翼翼地把它们挑出来，这个过程简直就像在微观世界里进行一场精细的外科手术。
线虫分离虽然听起来有点复杂，但其实就像一场有趣的微观冒险。
每一种分离方法都像是一种独特的魔法，帮助我们找到这些小小的线虫居民。
下次当你听到线虫分离的时候，可别觉得枯燥，要想象这是一场微观世界里充满乐趣的捉虫大作战哦！。
贝尔曼漏斗法分离土壤线虫
贝尔曼漏斗法分离土壤线虫
1、实验原理
由于趋水性和重力作用线虫会自动进入漏斗收集管
2、实验材料
2.1玻璃漏斗、橡皮管、夹子、烧杯、纱布
2.2 葡萄糖酵母菌培养基（50g葡萄糖，10g酵母粉）
3、实验方法
3.1取一根橡皮管，另一端连接漏斗，放置在架子上。
在漏斗中垫上滤纸，然后装入称好的30g土样。
将链接漏斗的橡皮管捏住，加水至浸没土壤，轻轻松一下橡皮管开口，使水有一部分流入橡皮管并与漏斗中的水联通，然后夹住橡皮管开口。
室温条件下分离，分别经过24h后，打开夹子，放出橡皮管内的水于烧杯中，镜检液体中是否含有线虫
4、参考文献
土壤线虫培养方法研究刘志典
土壤线虫三种分离方法效率比较毛小芳
土壤根结线虫的分离与密度调查唐跃辉
一种根结线虫的分离方法唐本安。
线虫分离方法
线虫分离方法线虫是一种小小的生物，别看它小，在科研、农业等很多领域都备受关注。
那怎么把线虫从它所处的环境中分离出来呢？这就像从一群混杂的小伙伴里挑出特定的朋友一样，是个有趣又需要技巧的活儿。
要是从土壤里分离线虫，有一种漂浮法。
先准备好合适的溶液，这溶液就像是为线虫特制的小泳池。
把含有线虫的土壤放进这个小泳池里，土壤里的线虫啊，就像是在泥土房子里住腻了，一看到这个新的溶液环境，就开始游动起来。
因为线虫的密度和土壤里其他东西不太一样，在溶液里待一会儿后，线虫就会漂浮起来，而那些沉重的土粒啊就沉在下面。
这时候，就可以用小工具，像是小网兜之类的，轻轻把漂浮着线虫的溶液捞起来，就像从池塘里捞鱼虫一样，线虫就这么被分离出来了。
还有漏斗分离法。
这就像是给线虫设置了一个特殊的滑梯。
做一个简易的漏斗，在漏斗里放上滤纸之类的东西，把带有线虫的土壤样本放在滤纸上。
然后在漏斗下面接个小容器，往漏斗里倒水。
水慢慢渗下去，就像一场小雨淋在土壤上。
线虫不喜欢在干燥的地方待着，就会随着水流穿过滤纸，滑落到下面的容器里，就像小朋友们从滑梯上滑下来一样欢快。
而那些土壤颗粒啊，就被滤纸挡住了，这样就把线虫成功分离出来了。
要是从植物组织里分离线虫，那就又有不同的办法。
有时候可以把植物组织切碎，放到一个容器里，加上水。
这就好比给线虫在植物这个大公寓里开了个逃生通道。
线虫在植物组织里感觉到环境变化了，就会游到水里。
过一段时间后，把植物残渣过滤掉，剩下的水里就有我们想要的线虫了。
还有一种是利用线虫对某些化学物质的趋向性。
就像人闻到香味会走向食物一样，线虫会朝着特定化学物质的方向游动。
我们可以设置这样一个环境，让线虫主动从植物组织游向我们设定好的区域，从而达到分离的目的。
在实际操作这些方法的时候啊，有好多小细节得注意。
比如说用漂浮法的时候，溶液的浓度一定要调配好，太浓了线虫可能游不动，太淡了又不能很好地把线虫和其他东西分开。
这就像做菜放盐一样，多了少了都不行。
线虫分离方法
线虫分离方法第一篇：线虫分离方法线虫分离方法分离线虫可采用贝尔曼漏斗法和浅盘法。
贝尔曼漏斗法：将玻璃漏斗（直径为10–15 cm）置漏斗架上，下面接一段（10 cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个止水夹。
将劈成“火柴杆”状大小的分离材料，取湿重10 g，用两层纱布包好，放入漏斗中，然后放入清水，清水以浸没分离材料为度。
经过4–24 h，由于趋水性和本身的重量，线虫离开植物组织，并在水中游动，最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。
打开止水夹，取底部约5–15 ml的水样，其中含有样本中大部分活动的线虫。
在解剖镜下检查，如果线虫的数量少，可以离心（1500 r/min，2–3 min）沉降后再检查。
浅盘法：浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成，其中口径略小的一只底部为粗网筛，放在另一只浅盘上面。
将两层纱布打湿铺于筛盘上，把样品劈碎（或钻取的木屑）置于筛盘纱布上，慢慢注入清水，使水浸没样品。
分离结束后，移去筛盘，把大盘内的分离液集中于小烧杯内。
小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机（1500 r/min，2–3 min）浓缩至适宜的量，以便镜检。
常规镜检：分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。
对有线虫的样品进行活体镜检，观察它的一般形态结构。
然后选择几条成熟、特征易观察的线虫，用针或吸管移至载玻片上的水滴中。
将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次（5–6 s）或放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，蒸30–60 s至虫体死亡，加盖玻片后在显微镜下观察。
根据形态特征予以初步鉴别，以确定是否需作进一步的鉴定。
快速镜检：（1）用显微镜直接观察线虫浓缩分离液。
分离液经一定时间后，当漏斗下端和乳胶管内出现透明度降低甚至混浊现象、表明线虫的游离量较多时，即可用培养皿接取混浊状分离液3–5滴，直接置于解剖镜下观察；如有线虫，就将盛有分离液滴的培养皿，放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，进行30–60 s的热杀处理，擦干培养皿底部凝结的小水珠，直接放置于显微镜下（先用低倍物镜，找到目标线虫，再转换到高倍物镜）观察形态特征予以鉴别。
植物线虫分离方法
植物线虫分离方法
植物线虫是一种常见的土壤寄生线虫，其卵可在植物根际中休眠，在适当条件下孵化成幼虫，然后侵入植物根部，对植物造成危害。
为
了研究其生物学特性和进行危害防治研究，需要对其进行分离和培养。
下面将介绍一些常用的植物线虫分离方法。
1.灯光法分离
灯光法分离是一种简单易行的植物线虫分离方法。
将植物根际土
壤取出，放入浅盘中，挖出一些形态正常、大小适中的植物根系，用
刀片切成约1cm长的段，放置在寒光灯下，将灯和试管一起放置在一起，照射时间为6-8小时。
待灯光照射结束后，将试管倾斜，用胶头
玻璃棒将从根系中排出来的线虫转移至其他培养器皿中即可。
2.蒸馏水分离
蒸馏水分离是一种常用的植物线虫分离方法。
将植物根际土壤取出，放入蒸馏水中，用力搅拌，过滤后利用离心机离心分离线虫。
离
心后，将上清液倒出，留下沉淀，用显微镜观察沉淀中是否有线虫，
如有可以再次取出上清液进行离心分离。
3.砂土分离
砂土分离是一种比较精细的植物线虫分离方法。
取出植物根际土壤，加入1:1体积比的甲醇和乙醇的混合液，用加热器加热至80℃，
然后均匀混合，放置3-4小时。
再用浸入甲醇-乙醇混合液中的筛网过滤，将筛网中的残渣用水清洗，收集精细的沉淀，用离心机分离线虫。
以上是一些常用的植物线虫分离方法，其中灯光法和蒸馏水分离
法操作简单，但分离效果较差，适用于大批量分离。
砂土分离法分离
效果较好，适用于少量、高质量的线虫分离。
注意，在实验中应严格
控制温度、时间和培养条件，以保证线虫的幸存率和健康度，从而提
高实验结果的准确性。
土壤根结线虫的分离与密度调查
出的线虫和方法一进行对 比；或将其稀释后 ， 取 ｌｍ 用方法一统计 出线虫数量 ， Ｏｌ 重复三次 ， 取平均
值 ， 方 法 一 进 行 对 比 。 采 用 唐 启 义 ［ 著 的 和 并 ２ １ 编
进行 方差分 析 。
２１ 线虫 分离效 果 ．
图 １直径 ５ｒ ｅ 的培养皿 ａ
图 ２直径 ９ｒ ｅ 的培养皿 ａ
２ ０ 。 １ ７ ：４ ４ ． ０ １２ （ ）４ — ５
分析时 ， 由于区组 内数据差距过大 ， 造成 了区组间
根结线虫主要为害各种蔬菜 的根部 ，还能传
播 一 些 真菌 和 细菌 性 病 害 。通 过对 土 壤 根线 虫 的 分 离 和密 度 调 查 ，可 以 了解 农作 物 根 结 线虫 田间 发 生 规律 ， 掌握 其 发 生 的关 键 时期 ， 为提 出综 合 防 治 措施 提供 理论 依据 。 目前 ， 虫 的分 离 方 法 主要 有 贝曼 漏 斗法 、 线 蔗
具体方法 ： 先用方法一统计线虫数量 ， 再将溶
・
２ ・ ０
温州农业科技
和 冬季 低 温下 正 常 生长 。 ２年 观察 ， 季 均 能 在 经 冬
抗 腐 烂病 和红 蜘蛛 的能 力也 较差 。
大棚内适应短期 ０ ℃以下的低温 ， 白玉龙耐低温 但 最强 ， 红仙蜜 １ 号其次 ， 龙珠耐低温最差 。 当大棚
在 体视 显 微 镜下 观察 发 现 ，采 用 这 种方 法 分 离 到 的线 虫 比较 干净 ，而 且细 小 颗粒 和 杂物 比较
少 ， 会影 响 到线 虫 统计 。 不 分离 得 到 的线 虫数 量 也
１ 线 虫统 计方 法 的应 用 ． ５
方法一将收集到的线虫溶液在体视镜下直接 统计 出来 ， 由于培养皿小 ， 当线 虫数量不 多时 ， 可 以轻松地将全部线虫数量统计 出来 ， 十分准确。 当
土壤线虫防治措施
土壤线虫是一种常见的地下害虫，对农作物和园艺植物造成严重损害。
以下是一些常见的土壤线虫防治措施：
1.合理轮作：通过合理的轮作，可以减少土壤中线虫的积累。
将易感植物与抗线虫的植物
进行交替种植，有助于打破线虫的生命周期，降低其数量。
2.土壤消毒：使用化学药剂或热处理等方法对土壤进行消毒，以杀灭线虫。
化学药剂可选
择合适的杀线虫剂，并按照产品说明进行使用。
热处理可以通过蒸汽、太阳辐射等方式进行。
3.使用抗性品种：选择具有抗线虫能力的品种进行种植。
一些作物品种已经培育出对特定
线虫具有抵抗力的性状，选择这些品种可以有效减少线虫的损害。
4.生物防治：利用线虫的天敌或寄生线虫来控制害虫数量。
例如，某些线虫寄生性真菌和
昆虫可以用于生物防治土壤线虫。
5.土壤改良：改善土壤质量和环境，提高植物的健康状况，从而减少线虫对植物的损害。
包括增加有机质含量、保持适当的湿度和排水性等。
6.合理施肥：避免使用过量的氮肥，因为过多的氮肥会刺激线虫繁殖。
合理的施肥管理可
以降低线虫的发生和繁殖。
7.土壤调理剂：使用一些具有线虫抑制作用的土壤调理剂，如壮苗灵、硫磺等，可以帮助
控制线虫的数量。
以上是一些常见的土壤线虫防治措施，根据具体情况和不同作物的需求，可以选择适合的防治方法来控制线虫的侵害。
土壤线虫的分离方法
土壤线虫的分离方法
钟雪超
【期刊名称】《环境》
【年(卷),期】2012(000)0z1
【摘要】分离土壤中的线虫是研究土壤线虫的基本环节,也是重要环节.采用何种方法分离线虫,主要根据分离目标线虫的生物学特性和样品属性而定.本文介绍了3种基本分离方法和在此基础之上通过改良和组合应用的3种改良分离方法.
【总页数】2页(P147,149)
【作者】钟雪超
【作者单位】深圳市南山区农业技术推广站广东深圳518025
【正文语种】中文
【相关文献】
1.蔗糖离心法分离土壤线虫的最佳条件筛选 [J], 陈立杰;王旭;段玉玺;孙晓铭
2.土壤线虫气泡悬浮法快速分离提取装置研制 [J], 王宏毅
3.基于贝尔曼漏斗法的土壤线虫最优分离时长探究 [J], 普国庆;罗丹;赵成法;谭坤;刘硕然;肖文;李延鹏
4.正压式线虫快速富集装置对土壤线虫分离效果的研究 [J], 孙萌;董荟慧;赵雅津
5.土壤线虫三种分离方法效率比较 [J], 毛小芳;李辉信;陈小云;胡锋
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土壤线虫几种处理方法比较
一 １ ２１ —
上海农业科技
２０１４—１
２０１３年大丰市春玉米粗缩病重发原 因分析 及绿色防控技术
一 种世界性病害 ，常常造成作物大 面积减产 ，危害农业 生产 减少 ，与土层 深度 ｌ５０、２００ ｍｍ 相比 ，在土层 ｉ００ ｍｍ时 ，
安全。据报道 ，引起植 物侵染性病 害的四大病 原 中，土壤 线 微波杀灭 线虫的效果最 为明鼠 其 中处理 时间为９０ ｓ时杀 灭
虫高于细菌 、病毒 ，仅次于真菌 ，全世界每年 因植物寄生 线 效果最佳 ，土壤 中根结 线虫降低 了８２．３％。微波处理法相 比
热处理 是通 过人为制造高 温环 境 ，使土壤 温度 达到线虫 该药剂能显著 降低 线虫群体数量；杀线剂的药效随用药量 的
致死 温度 ，从而杀灭线虫 的一种处理方 法 ，该 种方法简单有 增加 、处理 时间的 延长而提高 。
效 ，杀灭率高 ，且无公害。 如周璐 等分别采用铁锅 蒸煮法 、密 ２．２ 熏蒸剂处理
闭砖窑 热处理仓 干热处理花卉栽 培介质 ，并对两种处理 方法
土壤检疫处理 中常用 的熏蒸剂包 括溴 甲烷 ，硫酰 氟等 ，
的效果进行 比较 ，结果 ５５ ℃蒸煮 ３ ｒａｉｎ、６０ ℃蒸煮 １ ｒａｉｎ， 其 中溴 甲烷穿 透性能 良好 、扩散迅速 、一般植物能容忍 、对
杀 线虫率达 １００％ｌ ７０ ℃干 热处 理 ５ ｒａｉｎ以上 ，介质 中线虫 线虫等有害生 物毒 性高 ，使用最为广 泛。但溴 甲烷作为土壤
杀灭率达 ｌｏ０％。比较这 两种处理 方法 ，蒸煮法处理 温度低 ， 熏蒸剂 ，在使用后有 ３０％～８５％进人 大气 ，能破 坏臭氧层 ，因
但 一次处理 量较小 ，无 法大规模推广 ，且处理 后需晾晒方 可 而被联合 国环 境保护组织 （ＵＮＥＰ）列为限控物质 ，２０１５年
土壤线虫分离方法
1.贝尔曼漏斗法2.蔗糖离心浮选法[1]：操作步骤如下1）将土样放入离心管中2）加水，搅匀( 30g/100mL )3）离心(2000r/min )4）弃上清液，加饱和蔗糖溶液，搅匀5）离心(2000r/min)6）将上清液注进预先装水的烧杯7）过筛网（300目、400目、500目套在一起）8）分别将线虫洗到培养皿中（为了便于立体解剖镜下计数，可用带平行横纹的塑料培养皿）注：20℃时，蔗糖溶解度204g, 溶液浓度为67.09％25-30℃时，﹤68％3.浅盘法：1）将10目的不锈钢筛盘放入配套浅盘中2）在筛盘上放置两层纱网再放一层滤纸，将土样均匀铺在滤纸上加水浸没土壤3）室温条件下分离，分别经过24、36、48小时后，收集浅盘中的水后同离心悬浮法用三个套在一起的筛网过筛，冲洗，收集，计数（线虫条数/100g干土）大蜡螟活体培养法，侵染期幼虫用线虫诱集盘收集[2-5]。
线虫的分离采用大蜡螟诱集法。
大蜡螟为室内人工饲料饲养的5-7龄幼虫。
先在直径7厘米、高10厘米的罐头瓶内放5头大蜡螟幼虫，然后分别装入500克采集的土样，在23℃下保持5-7天，检查大蜡螟幼虫死亡情况。
将死亡的幼虫单头放于线虫收集盘上收集线虫，然后用大蜡螟幼虫扩繁一次，编号整理......侵染韭菜蛆参考文献：[1]毛小芳，李辉信，陈小云，胡锋，土壤线虫三种分离方法效率比较[J],生态学杂志，2004，23（3）：149-151[2]杨秀芬，简恒，杨怀文，刘峥，袁京京，用昆虫线虫防治韭菜蛆[J],植物保护学报，2004,31(1):33-37[3] DUTKY, SR; THOMPSON, JV; CANTWELL, GE.A TECHNIQUE FOR MASSPROPAGATIONOFDD-136NEMATODE,JOURNALOFINSECTPATHOLOGY 1964,6 ( 4 ) :417-422[4] Poinar G O.Nematodes for biological control of insect.CRC Press,Boca Raton,Florida,1979[5]张刚应，杨怀文，张善稿，简恒，北京地区昆虫病原线虫的自然发生情况初步调查[J]，生物防治通报，1992，8（4）167-169。
植物病原线虫的分离方法及形态观察实验
植物病原线虫的分离一、目的要求了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的常用方法。
学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。
二、基本原理植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。
植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。
线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。
三、材料、试剂与仪器1．实验材料感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。
2．仪器或实验用具解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。
3．试剂线虫固定液。
四、实验操作1．直接观察分离对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。
取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。
用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。
2．漏斗分离法该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。
其装置是将直径10~ 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10 cm 的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。
（1）将植物材料切碎用双层纱布包好，浸在盛满清水的漏斗中，或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸，上面加一层土样。
土壤线虫分离方法及注意事项
土壤线虫分离方法及注意事项
1.准备好分样用的器具，塑料筐底部放入一层250mm ⨯ 250mm规格的润湿的纱布，
上放入一层206mm ⨯ 195mm规格的抽取式面巾纸（清风：原木纯品，无味、沾水不易破裂。
）；
2.每个土样用100ml烧杯量取100ml土，均匀的平铺在面巾纸上；
（注意：土壤要混匀，不能出现大的土壤颗粒。
）
3.盆内倒入一罐头瓶自来水约500 ml，然后把盛有土样的框缓缓的坐入盆中；
（注意：不要用力过猛，以防土壤中细微颗粒进入水中；夏天温度较高，水分蒸发较快，可以多加50ml自来水。
）
4.室内静置48h后，筐慢慢拿出水面，轻轻拍打框壁让水滴落入盆内的线虫悬浮液
中，约30s后，立即拿到室外晾干，把盆中的线虫悬浮液充分摇匀转移至500ml 罐头瓶中；
（注意：罐头瓶数量有限，可以用500ml烧杯代替；室内静置时不要移动器具，如空间不够需要移动时，尽量保证不要晃动液面，轻轻平移。
）
5.静置3-5h，之后用橡胶管虹吸上清液，留下约100ml线虫悬浮液至140ml的玻
璃管中；
（注意：用橡胶管吸去上清液时，把管口沿着液面往下移动，不能直接插入容器底部，这样容易吸走线虫）
6.再次静置3-5h，吸去上清液，留下约15-20ml线虫悬浮液转移至25ml的试管中，
7.再次静置3-5h，吸去上层清液，留下5ml线虫悬浮液，4℃冰箱保存，7d内完成
管内线虫的鉴定。
✧所有操作过程当中一定要轻拿轻放，切勿漏洒，以免人为造成试验误差！
✧所有器具用过之后，及时清洗、晾晒、收回，放回原处，以便下次使用，切
勿拖沓，养成良好试验习惯。
实验三植物线虫的分离与计数
实验三植物线虫的分离与计数一、实验目的通过本实验，掌握从土壤和植物中分离植物线虫的基本原理，学会从土壤和植物植物中分离线虫的常用方法---漏斗分离法，并掌握线虫的计数方法。
二、实验原理将带有线虫的植物组织或土壤浸在水中，短时间内在水中检查不到线虫；但经过较长的时间，线虫由于趋水性，就会离开植物组织或土壤在水中游动，又由于本身的重量即比重大于水，最后都逐渐沉降到容器的底部，从而将植物线虫分离出来。
三、实验器皿与试材1.主要器皿：漏斗（直径为10-15cm）、胶皮管、支架、夹子、线虫滤纸、纱布、计数皿、解剖镜、小烧杯等。
2.主要试材：感染根结线虫病的植物病根或病土四、实验方法与步骤该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。
具体方法如下: 1•将玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段橡皮管（长约10cm左右），橡皮管上装一个弹簧夹，如图1。
2.在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤中的线虫时须在网筛上放一层纱布或滤纸，上面加一层土样。
3.沿壁缓慢的加入自来水，不然会搅动土样，使下层的水混浊。
4.打开弹簧夹，慢慢放出底部约5ml的水样于计数皿内。
5.在解剖镜下观察分离到的植物线虫并计数。
若线虫数量太少，可将水样倒入离心管中，在1500r/min离心机中离心3-5分钟，倒掉上层清水，将下层沉淀物悬浮后，倒入计数皿中，在解剖镜下观察计数。
计数皿为图1制斗仆离装豊阳掘土样的対布番界舸纱网乳水九橹皮督$知賢史已小鼓皙观离心管一特制的小玻璃皿，有分格的刻度，四周边缘适当倾斜，如图2。
计数时在解剖镜下数出每个小格中线虫数，然后相加即总线虫数。
五、实验注意事项1•玻璃漏斗内加满水以后，停几分钟后一定要观察橡皮管是否漏水，如果有滴水现象，一定要重新调整弹簧夹位置，确保弹簧夹夹牢橡皮管不漏水。
2.用计数皿计数时，注意双刻线是起始位置，从这个位置开始，到这个位置结束，不容易重复计数。
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土壤线虫三种分离方法效率比较＊毛小芳 李辉信＊＊ 陈小云 胡 锋(南京农业大学资源与环境科学学院农业资源与生态环境研究所,南京210095)摘 要 比较了蔗糖离心浮选法、改进的贝尔曼漏斗法和浅盘法对土壤线虫的分离效率。
蔗糖离心浮选法分离得到的线虫总数分别为贝尔曼漏斗法的6.1倍和浅盘法的11.4倍。
而且离心浮选法分离得到的虫体大于53μm (>300目)和53～40μm (300～400目)的线虫数显著高于贝尔曼漏斗法和浅盘法。
离心浮选法对所有功能类群线虫(包括食细菌、食真菌、植食和杂食线虫)的分离效率也均显著高于其他2种方法。
贝尔曼漏斗法的分离效率高于浅盘法,主要反映在食细菌线虫和虫体在40～32μm (400～500)的线虫数。
但在达到相同分离效率时,浅盘法比贝尔曼漏斗法需要的时间短。
关键词 土壤线虫,分离效率,蔗糖离心浮选法,贝尔曼漏斗法,浅盘法中图分类号 S154 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2004)03-0149-03Extraction efficiency of soil nemato des by dif ferent methods .M AO Xiaofang ,L I Huixin ,CHEN Xi -aoy un ,HU Feng (College o f Resour ces and Env ir onmental Sciences ,Institute of Agr icultur al Re -so ur ces and Eco -Environment ,N anjing A gr icultur al U niversity ,Nanj ing 210095,China ).Chinese Jour nal o f Ecology ,2004,23(3):1～.Extraction efficiency of soil nematodes by density (sucro se )centrifugation ,modified Baermann funnel and shallow dish methods w as compared .T he total numbers of nematodes extracted by centrifug atio n method w ere 6.1and 11.4times hig her than those by Baermann funnel and shallo w dish methods ,respectively .Nematodes of body size more than 53μm (>300mesh )and between 53μm and 40μm (300～400mesh )ex tracted by centrifuga tio n me thod were also significantly higher than those by Baermann funnel and shallo w dish methods .I n addition ,centrifug atio n method w as more effective for the ex traction of all functional g roups of nematodes (including bacterial -feeding ,fungal -feeding ,plant -feeding and omnivorous nemato des )than Baermann funnel and shallow dish methods .Baermann fun -nel method sho wed higher extraction efficiency than shallow dish method ,and the difference w as re -flected in the numbers of bacterial -feeding nematodes and the nematodes with body size between 40μm and 32μm (400～500mesh ).However ,shallow dish method w as faster than Baermann funnel method when reaching similar relative ex traction efficiency .Key words soil nematodes ,extraction efficiency ,density (sucrose )centrifugation method ,modified Baermann funnel method ,shallow dish method .＊教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留[2001]345号)和人事部留学回国人员科技活动择优资助经费资助(宁人字[2002]44号)。
＊＊通讯作者收稿日期:2003-02-13 改回日期:2003-05-201 引 言土壤线虫是土壤动物的主要功能类群之一,是土壤中最为丰富的后生动物,广泛分布于土壤中,数量可达7.6×105～9.2×106条·m -2[3,6]。
对土壤中的线虫分离是土壤线虫研究的基本环节,也是重要的环节。
目前,土壤线虫的分离方法主要采用蔗糖离心浮选法、贝尔曼漏斗法和浅盘法[1,8]。
不同分离方法的效率已有少量报道[2,4,7],但主要是对线虫分离总数的比较,而不同分离方法对各种功能类群的线虫和不同虫体大小的线虫分离效率的影响尚未见报道。
本文就不同分离方法对土壤线虫总数、虫体大小以及功能类群的分离效率进行了比较,旨在为不同研究目的选择适合的分离方法提供依据。
研究表明[1,5,8],贝尔曼漏斗法及浅盘法对土壤线虫的分离时间一般为24～48h ,为了在尽量短的时间内达到线虫分离目的,对这两种分离方法不同时段的分离效率也进行了比较研究。
2 材料与方法2.1 材料供试土样采自南京市雨花区菜地,土壤类型为黄刚土。
将采集的0～20cm 鲜土小心掰碎,并拣取其中杂物,混匀,4℃冰箱保存。
2.2 方法2.2.1 离心浮选法(density (sucrose )centrifug ation生态学杂志Chinese Journal of Ecology 2004,23(3):149～151method) 将30g供试土样放在离心管内,加约100 ml水并充分小心搅匀,置于离心机内以2000r·min-1离心5分钟,弃去上清液,加进配好的800g·L-1蔗糖溶液搅匀,再次以2000r·min-1离心5分钟,将上清液注进预先装水的烧杯里,用300目,400目,500目网筛套在一起,将烧杯内的水倒入筛网,并用水冲洗,最后将三个筛网里的线虫分别洗到带平行横纹的塑料培养皿中,置于立体解剖镜下计数。
2.2.2 贝尔曼漏斗法(modified Baermann funnel method) 在口径为20cm的塑料漏斗末端接一段橡皮管,在橡皮管后端用弹簧铗夹紧,在漏斗内放置一层铁丝网,其上放置两层纱网,并在上面放一层线虫滤纸,把100g土样均匀铺在滤纸上,加水至浸没土壤。
置于20℃室温条件下分离。
分别在经过24、36、48h后,打开夹子,放出橡皮管内的水于小烧杯中,然后同离心浮选法一样,用三个套在一起的筛网过筛,冲洗,收集,计数。
2.2.3 浅盘法(shallow dish method) 将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中,在筛盘上放置两层纱网,再放一层线虫滤纸,然后把100g土样均匀铺在滤纸上,加水至浸没土壤。
置于20℃室温条件下分离。
分别在经过24、36、48h后,收集浅盘中的水,然后同离心浮选法一样,用三个套在一起的筛网过筛,冲洗,收集,计数。
上述试验每个样本重复3次,获得的数据最后换算成线虫条数·100g-1干土。
2.2.4 土壤线虫功能类群的鉴定方法 根据线虫的口针、食道及尾部形态等特征的不同,将线虫分为食细菌(bacterial-feeding)、食真菌(fungal-feeding)、植食(plant-feeding)和杂食(om nivorous)线虫4个功能类群[9,10]。
3 结果与分析3.1 三种方法对土壤线虫的分离效率比较表1列出了三种方法所分离得到的土壤线虫总数、不同虫体大小和不同功能类群的线虫数。
从线虫总数来看,其分离效率表现为:离心浮选法>>贝尔曼漏斗法>浅盘法,其中离心浮选法分离的土壤线虫数是贝尔曼漏斗法的6.1倍、浅盘法的11.4倍,差异达极显著水平(P<0.01)。
虽然贝尔曼漏斗法分离的线虫平均数较浅盘法高,但两者之间没有显著性差异(P<0.05);从线虫体大小的数量来看,离心浮选法分离的>300目和300～400目的线虫数显著高于贝尔曼漏斗法和浅盘法,而400～500目的线虫数则是离心浮选法和贝尔曼漏斗法相当、但显著高于浅盘法,这表明贝尔曼漏斗法尽管在线虫总数上显著低于离心浮选法,但小线虫数(400～500目)并不明显低于离心浮选法,也就是说贝尔曼漏斗法对小线虫的分离效率相对较高。
分析不同功能类群的土壤线虫数量可知,该土壤的植食线虫占优势,占土壤线虫总数的59.2% (离心浮选法)、59.3%(浅盘法)和46.3%(贝尔曼漏斗法),其次为食真菌和食细菌线虫,杂食线虫只占2%左右。
离心浮选法分离得到的4种功能类群的线虫数均显著高于贝尔曼漏斗法和浅盘法;其中,贝尔曼漏斗法和浅盘法相比,前者的食细菌线虫数显著高于后者,而其他3种功能类群的线虫数无显著差异。
表1 三种方法分离的线虫数(条·100g-1干土)Tab.1 T otal numbers of soil nematodes extracted by three methods(no·100g-1dry soil)分离方法线虫总数>300目线虫300～400目线虫400～500目线虫食细菌线虫食真菌线虫植食线虫杂食线虫离心浮选法3956.4±346.6a738.8±198.1a2893.6±435.6a324.2±70.9a840.4±43.2a691.0±123.9a2341.2±251.8a84.1±16.9a 贝尔曼漏斗法(48h)650.5±59.9b92.8±30.8b298.4±26.0b259.4±19.8a145.7±38.0b185.1±54.0b301.3±34.9b18.5±2.1b 浅盘法(48h)346.0±44.5b55.4±16.3b166.6±4.0b123.9±61.2b41.0±8.6c93.2±15.3b205.2±21.5b6.6±2.6b 注:同一列内字母相同表示无显著性差异,字母不同表示有显著性差异,多重分析采用Duncan's法。