绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
２．１ ＧＦＰ的理化性质 从水母体内分离到的ＧＦＰ基因，长达２．６ｋＤ，由
３个外显子组成，分别编码６９、９８和７１个氨基酸。 ＧＦＰ本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。 Ａｅｑｕｏｒ／ａ ＧＦＰ分子量约２７×１护，一级结构为一个由 ２３８个氨基酸残基组成的单链多肽；而Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ 是分子量为５４ｋＤ的同型二聚体。两种ＧＦＰ有不同 的激发光谱，Ａｅｑｕｏｒ／ａ ＧＦＰ在３９５ ｎｍ具有最高光吸 收峰，肩峰为４７３ ｒｉｍ；Ｒｅｎ／／／ａ ＧＦＰ在４９８ ｎｎｌ具有强 烈的光吸收，肩峰为４７０ ｎｒｎ。两种ＧＦＰ含有相同的
（４）构建载体方便。由于编码ＧＦＰ的基因序列 很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒， 而不至于使质粒过大影响转化频率。
（５）可直接用于活细胞测定。ＧＦＰ是能在异源 细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且ＧＦＰ 的分子量较小，Ｎ一端和Ｃ一端都能忍受蛋白的融
合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察， 更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察 蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到 外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显 微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微 镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进 行三维显示。
ｏｆ ＧＦＰ ａ弛ｒｅｖｉｅｗｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｗ蜘ｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍａｒｋｅｒ；Ｆｋ，，ｏｒｅｗ．ｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｈｏｇｒｅｓｓ；ｈｕｐｒｏｖｅｍｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
绿色荧光蛋白标记技术的研究成就与展望
绿色荧光蛋白标记科技的研究成就与展望2008年10月8日，日裔美国科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和华裔美国科学家钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。诺贝尔奖委员会将化学奖授予下村修、马丁·沙尔菲和钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。绿色荧光蛋白GFP的发现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是科学家从水母(Aequorea victoria)体内发现的野生型发光蛋白。其分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，在细胞生物学与分子生物学领域中，是常用的报导基因。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物,例如白鼠身上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。在大自然中，具有发光能力的生物有不少，萤火虫是陆地上最为常见的发光生物。在海洋里，某些水母、珊瑚和深海鱼类也有发光的能力。事实上，大多数发光动物能发光是靠两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果。不同发光生物的荧光素和荧光素酶结构是不一样的。因此，这些生物的发光本领只能是它们自己的“专利”。20世纪60年代，日本科学家下村修从美国西岸打捞了大量发光水母，带回位于华盛顿州的实验室进行研究。这些水母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧光，下村修希望找到这种水母的荧光素酶。然而，经过长期的重复努力，居然毫无收获。他大胆地假设，这种学名叫Aequorea victoria的水母能发光也许并不是常规的荧光素/荧光素酶原理。他想，可能存在有另一种能产生荧光的蛋白。此后，他进行了更多的实验，终于搞清楚了这种水母的特殊发光原理。原来，在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白。 绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细
绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用
的。在荧光显微镜强光 照射下 ， Ｆ Ｇ Ｐ抗光漂白能力较强 ， 特别在
Ｇ Ｐ分子量约为 ２ １ 是由 ２ ８个氨基酸残基组成的单 真核细胞 中都可表达为有活性 的 Ｇ Ｐ 具有活体 、 Ｆ ７ ０。 Ｘ ３ Ｆ， 原位 、 实时表 链多肽 『 ２年 日裔美籍科学家下村修首次从水母 中分离出 达的特点 （） ｌ ９ １ ６ 。１ ； 结合倒置荧光显微镜动态观察 目的基 因在活细胞 ３ Ｇ Ｐ并发现其可以在紫外线照射下发出绿光；９４年美国科学 中 的表 达 更 直 观 。 辨 率 高 ； ） 测 方便 ， Ｆ， １９ 分 （检 ４ 只需 要 紫 外 光 或蓝 色
既有荧光又有宿主 作者简介： 吉芸（９６３ ）女 ， 卫 １８ ．．， 在读硕士研 究生： 主要研究方向： 动物 成融合子来监测宿主蛋 白的定位和最后归宿 ，
生物化 学与分子 生物学 ；邮箱： ｉｖ ｎ １ ６７ ＠１３ ｏｌ ｗｅｉａ ． ２ ３ ６ ｎ 。 ｊ ３１ ｃ
２ ＧＦ Ｐ的应用特点
２ 世 纪 ， Ｆ 为 一种 新 的报 告 基 因Ｔ 具 得到 了迅 速发 展 ， １ Ｇ Ｐ作
绿色荧光蛋白研究进展
绿色荧光蛋白研究进展
动物医学进展,2008,29(1):56259
Progress in Veterinary Medicine
绿色荧光蛋白研究进展
王晓丽1,邵卫星2,单虎13
(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266071)
摘要:来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。
关键词:绿色荧光蛋白;选择标记基因;应用
中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120056204
随着生命科学和医学研究的不断深入,研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因,目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline p ho sp hatase, SEA P)基因、β2半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β2葡糖苷酸酶(glucosidase,GU S)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase,L UC)基因等[1],但这些基因的检测方法并不理想,它们都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。一种全新的非酶性报告基因———绿色荧光蛋白(green fluorescent p rotein, GFP)引起了人们的关注[2],该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。作为报告基因,GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白;作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率,
绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用
细胞内许多酶的作用，例如：蛋白水解酶、激酶、 氧化还原酶以及一些小配基的浓度[20]。
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7 用于细胞示踪实验研究
利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵 袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以 往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗 原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操 作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行 示踪。
另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光 光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一 定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正 计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小 和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数[19]。
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2 细胞筛选
基于GFP能够吸收、发射光，并且荧光稳定以及检测方法 快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。譬如应 用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等 [14]使用GFP 作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下， 仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外，研究发现 通过GFP 荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡 [15]。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记，通 过筛选已经获得GFP表达的E.coli、人体肾细胞和猿猴 COS- 1细胞等特殊类型。Sheen J 等在GFP转染玉米原 生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色 荧光，约占细胞总数66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧 光，荧光强度是对照的74 倍[16]。因此，用流式细胞计 数仪或荧光活化细胞计数仪( FACS) 很容易将两类细胞分 离开来。
绿色荧光蛋白分子量
绿色荧光蛋白分子量
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种广泛应用于生物医学研究领域的蛋白质。它具有独特的特性，能够发射绿色荧光，因此被广泛应用于标记和追踪生物活性分子和细胞结构。
绿色荧光蛋白的分子量约为27千道尔顿（kDa），这使得它在细胞内的表达和运输过程中具有一定的灵活性。虽然分子量只是蛋白质的一个物理特征，但它对GFP的功能和应用具有一定的指导意义。
首先，绿色荧光蛋白的分子量决定了其相对较小的大小。这使得GFP能够容易地在细胞内定位，并且不会对细胞内的生理过程产生显著的影响。相比之下，较大的蛋白质可能会干扰细胞的正常功能。因此，GFP的分子量使其成为一种理想的标记蛋白。
其次，绿色荧光蛋白的分子量还决定了其在凝胶电泳等分析技术中的迁移速率。通过测定GFP在凝胶上的迁移距离，可以粗略估计其相对分子量，从而判断特定变异或突变对蛋白质结构和功能的影响。这种分子量估计方法为研究人员提供了一个快速且可靠的检测手段，用于评估GFP的纯度和结构完整性。
除了这些理论上的指导意义，绿色荧光蛋白的分子量对于生物医学研究也有着实际的意义。由于其较小的分子量，GFP可以更容易地穿过细胞膜，并在细胞内扩散到需要观察的区域。利用这种特性，科学
家们可以将GFP与其他蛋白质结合，用于研究细胞内的交互作用和信号传导过程。这在药物研发和疾病治疗方面有着重要的应用前景。
总之，绿色荧光蛋白的分子量是其功能和应用的重要指标之一。它的相对较小的分子量使其成为一种理想的标记蛋白，方便研究人员在细胞内定位和追踪生物活性分子。此外，GFP的分子量还可以通过分析技术估计，用于评估其纯度和结构完整性。未来，随着对GFP技术的进一步研究和发展，相信它将在生物医学领域发挥更重要的作用。
绿色荧光蛋白的应用及发展前景
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景
姓名周紫嫣学
号014010110349
专业生物工程
指导教师周小萍职
称教师
中国·武汉二○一二年四月
目录
摘要·························II 关键词·························II Abstract ························II Key words ·······················II
1 GPF的发现 (1)
2 GFP的结构及发光原理 (1)
2。1 GFP的结构 (1)
2。2 GFP的发光原理 (2)
3 GFP在生物技术中的应用 (2)
3.1 GFP作为报告基因 (2)
3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3)
3.3 GFP用于药物筛选 (3)
3.4 GFP作为生物传感器 (3)
3.5 GFP用于融合抗体 (4)
3。6 GFP用于计算细胞生长速度 (4)
3.7 GFP用于基因表达调控 (4)
4 GFP存在问题及发展前景 (4)
参考文献 (5)
致谢 (5)
绿色荧光蛋白的应用及发展前景
摘要
绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母(Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸（Ser—Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置.其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.本文综述了绿色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景.
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在
于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿
色荧光。由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP
已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。
GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。GFP基因含有GFP编码序列，该序
列通过表达可以产生GFP蛋白质。GFP的荧光性质是由三个
氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。
在GFP的自然状态下，并不发出荧光。但当该基因被转录和
翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发
生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。
在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究
人员观察细胞内部的某些组分或结构。研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表
达GFP。由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜
直接观察到目标蛋白的位置和分布。
通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过
程中的变化，以及探索细胞活动的机制。此外，通过将GFP
基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子
生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。由于GFP
多种荧光蛋白
多种荧光蛋白
荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质，它们能够发出绿色、黄色、橙色、红色等不同颜色的荧光，被广泛应用于生物成像、
蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。本文将按照荧光蛋白的类别进
行介绍。
1. 绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（GFP）是最早被发现的荧光蛋白，它能够发出绿色荧光。GFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用
于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。GFP的应用范围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作用等领域。
2. 黄色荧光蛋白
黄色荧光蛋白（YFP）是一种能够发出黄色荧光的荧光蛋白，它是
GFP的变种。YFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。YFP的应用范
围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作
用等领域。
3. 橙色荧光蛋白
橙色荧光蛋白（OFP）是一种能够发出橙色荧光的荧光蛋白，它是
GFP的变种。OFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。OFP的应用范
围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作
用等领域。
4. 红色荧光蛋白
红色荧光蛋白（RFP）是一种能够发出红色荧光的荧光蛋白，它是
GFP的变种。RFP的发现和研究为生物学研究提供了一种全新的工具，它可以被用于研究蛋白质的定位、表达、交互等方面。RFP的应用范
围非常广泛，它被广泛应用于生物成像、蛋白质定位、蛋白质相互作
用等领域。
总结
荧光蛋白是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质，它们能够发出绿色、黄色、橙色、红色等不同颜色的荧光。不同颜色的荧光蛋白在生物学
绿色荧光蛋白及其应用
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.2
绿色荧光蛋白及其应用
周盛梅1 孟凡国2 黄大年3 黄纯农1
(1.杭州大学生命科学院 杭州 310012)
(2.山东农业大学生化系)
(3.中国水稻所基因工程系)
摘要 许多海洋无脊椎动物体内都含有绿色荧光蛋白,这种蛋白质结构很特殊,在受到激发时可以发射绿色或蓝色荧光。虽然对它的研究从本世纪六十年代才开始,但是它独特的性质逐渐引起了生物学界的广泛关注。本文将就绿色荧光蛋白的结构、性质及其应用前景作一综述。
关键词 绿色荧光蛋白 荧光 生色基 GFP基因
荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光:刺胞亚门的动物多发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。1962年,Shimo mura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequor ea V ictoria中分离、纯化出一种荧光物质,并将其定性为蛋白质,称为绿色荧光蛋白(Gr een Fluorescent Pro-teins,GFPs)。此后,人们对绿色荧光蛋白的结构、性质进行了不断的深入研究,随着这些研究的进展,人们发现,从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同,不同动物品种的荧光发生机理也有很大的差别。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(A equorea)和海紫罗兰科(R enilla)的荧光蛋白,即Aequorea GFP 和Renilla GFP(以下简称为A-GFP和R-GFP),其中对前者的研究相对更深入一些,应用也更为广泛。
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展
一、关键词：
绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健
二、背景
2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。
三、GFP的主要性能
GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮。GFP的晶体结构是由11个β-折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋，发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心。蛋白的二级结构大部分为α-螺旋和β-折叠。GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。
荧光蛋白家族的结构和功能研究现状及其应用前景
荧光蛋白家族的结构和功能研究现状及其应
用前景
荧光蛋白是一类具有广泛应用前景的蛋白质，它们能够通过吸收光线并将其转化为荧光的形式，因此在生物医学、生命科学等许多领域具有重要的作用。
荧光蛋白家族包括多种不同类型的蛋白质，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等，它们各有特点。例如，GFP可通过激发波长为395 nm的紫外线而发出绿色荧光，而EYFP（增强YFP）则是从蓝色到黄绿色的颜色变化。
关于荧光蛋白家族的研究，研究者们从三个角度出发进行了深入研究。
第一，关于荧光蛋白家族的结构与功能。在过去20多年里，科学家们已经对荧光蛋白家族的分子和结构进行了不断的研究，得出了许多重要的结构和功能的信息。例如，研究者们已经发现荧光蛋白家族中的许多成员具有一类特殊的结构及功能，这种结
构被称为类似于阶梯的结构，以绿色荧光蛋白为例，它的结构中
包含三个螺旋带（α1,α2和α3）以及几个折叠链。
第二，关于荧光蛋白家族的表观遗传学。表观遗传学是新一代
基因编辑技术中的一个重要领域，而荧光蛋白家族为其提供了有
力的支持。这些蛋白质具有高度可变性的表达及相互作用，可以
被组合和转换为其它相关功能以应对疾病和基因致病因素。
第三，关于荧光蛋白家族的应用前景。在现代科技的帮助下，
生命科学和医学领域对于荧光蛋白家族的应用已经成为了标志性
的成果。例如，新型癌症治疗、生物质（如生物燃料）研究、分
子分析等等领域都得益于荧光蛋白家族的广泛应用。例如，治疗
鼻咽癌的方法中，往往需要将荧光蛋白家族的各种成员物质注射
绿色荧光蛋白及其应用
从维 多 利 亚 多 管 水 母 中 分 离 出 来 的 野 生 型 GFP ( avGFP ) 由 238 个 氨 基 酸 残 基 组 成，分 子 质 量 约 27kDa，二级结构包括 11 个 β 折叠链( β-sheet strand) ， 8 个螺旋( helix) ，3 个转折( turn) ［图 1 ( a) ］，三维结构 ( PDB 登录号 1EMA 和 1GFL，1GFL 为二聚体) 为 42 × 24 ( 高 × 直径) 的 β 圆柱( β-barrel) ，圆柱两端由一 些较短的 α 螺旋盖住，圆柱中央是几段 α 螺旋，生色团 的三肽( Ser65-Tyr66-Gly67) 位于圆柱中央［图 1 ( b) ～ ( d) ］。该结构性质稳定，圆柱内部的微环境对维持生 色团的正确构象从而产生荧光以及保护生色团不被氧 气淬灭等都有重要作用［10］［图 1( e) ］。
( a) ． Secondary structure ( UniProt accession P42212) ; ( b) ． Side view: the tripeptide of chromophore locates in the center of β-barrel; ( c) ． To Pview; ( d) ． the tripeptide of chromophore ( uncyclized) ; ( e) ． The microenvironment surrounding the chromophore． ( b) ～ ( d) are generated from a subunit of wild type avGF P( PDB IGFL) ; ( e) ． from ref［10］
GFP应用综述
GFP荧光蛋白的应用概述
前言：源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。绿色荧光蛋白的发现具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并且在此基础上改造发展和发现了一些列荧光蛋白，扩展了应用范围。现就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
主要内容：
1、GFP的具体应用：
作为转基因植物和动物的筛选标记
用于定位标记
跟踪观察微生物
发育机理研究
用于细胞筛选
用于免疫学
2、GFP在生物领域的最新应用进展：
显像技术
失踪技术
报告基因
生物光学感受器
筛选技术
抗体生产
（1）显像技术
由于荧光蛋白有多种颜色，且稳定无毒，所以荧光蛋白可是的动物体内复杂的系统结构可视化。Livet等用多种不同的颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得我们能够观察到大脑的集成路线图，可以直观地看到神经细以及细胞间的相互作用。另外，荧光蛋白还可用于生物发育领域，能够形象的观察生物体的器官组织结构的变化，随着发育学研究的深入，荧光蛋白必将成为强有力的工具。
（2）失踪技术
一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂快，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于失踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助这一新技术，可以更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌，可以详细的对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷，GFP必将会进一步取代一般的荧光染料，有效地帮助学术研究者观察分析细菌病毒的感染方式。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用
一 GFP 的结构、特性与功能
❖ 1 GFP 的结构
❖ P rasher DC 首 先 克 隆 了 水 母 Jellyfish(A equorea v ictoria GFP)的cDNA[ 6 ],GFP编码的238个氨 基酸的多肽单体，推导分子量Mr=26888，与先前用变性电泳测得的天然 GFP 分子量 （30 KD a ） 接近。根据DNA序列推导的氨基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP 分子才会 产生生物荧光, 但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Ch rom opho re ) 的部位 （图2。在GFP的初级氨基酸序列上, 第65～67个氨基酸(SerˉTyrˉGly）ˉˉˉˉ
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及 其在分子生物学研究中 的应用
.
生物发光现象, 在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式 [ 1, 2 ]。在水母(Jellyfish) 中, 当能量从 Ca + + 活化的水母蛋白(A equo rin ) 转移到绿色荧光蛋白(Green F luo rescen t P ro tein, 简称GFP)上以 后，它即发出绿色荧光。活体GFP与纯化的 GFP 具有相同光谱特性, 即吸收蓝光, 放射绿光。可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分 光光度计进行活体检测 。由于GFP 稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧 光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 因 此它是一种独特的 报告蛋白(R epo rter p ro tein) , 可广泛用于基因的表 达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。90年代后, 有关GFP 及其利用的研 究进展较快，已引起分子生物学家极大的兴趣与关注。
GFP绿色荧光蛋白的应用前景
铁添加量以及探讨铁离子作为营养元素的分子作用机制。Henderson等通
过将铁离子反应原件（ironresponsiveelement，IRE）重组到GFP质粒 中，发现可以检测活细胞中铁离子调节蛋白（ironregulatoryprotein，
IRP）的活力，确定铁离子在细胞内的状态。例如：如果细胞内的铁离子
2.2示踪技术
一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂多，染料可
在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以
及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细 胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助于这一新技术，我们可以 更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌，可以详细地 对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染 源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷，GFP必将会 进一步地取代一般的荧光染料，有效地帮助学术研究者观察分析细菌、 病毒的感染方式。
2.6 抗体生产
由于新型病毒的鉴别特征有限，使得传统的抗体生产方法不 能被有效运用，生产抗体便遇到了极大的困难，而GFP的发现及 其在分子生物学中的应用解决了这一难题。Steela等将新型的病 毒—葫芦黄发育迟缓症病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus，YSDV）外壳蛋白植入GFP基因，并转入农杆菌，再将农 杆菌接入本生烟用于生产该病毒，然后再用GFP纯化的重组蛋白 －CYSDV便可制备多克隆免疫抗体。快速灵活的GFP抗体生产技 术在应对新型流行性病毒、及时控制疫情等方面必定会发挥巨大 的作用。
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学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景
姓名周紫嫣学
号014010110349
专业生物工程
指导教师周小萍职
称教师
中国·武汉二○一二年四月
目录
摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II
1 GPF的发现 (1)
2 GFP的结构及发光原理 (1)
2.1 GFP的结构 (1)
2.2 GFP的发光原理 (2)
3 GFP在生物技术中的应用 (2)
3.1 GFP作为报告基因 (2)
3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3)
3.3 GFP用于药物筛选 (3)
3.4 GFP作为生物传感器 (3)
3.5 GFP用于融合抗体 (4)
3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4)
3.7 GFP用于基因表达调控 (4)
4 GFP存在问题及发展前景 (4)
参考文献 (5)
致谢 (5)
绿色荧光蛋白的应用及发展前景
摘要
绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母（Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。本文综述了绿色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景。
关键词
绿色荧光蛋白；报告基因；药物筛选；融合抗体
Green fluorescent protein application and development prospect
Abstract
Green fluorescent protein (GFP) is a kind of the jellyfish (Aequorea Victoria) found in the body of the luminous protein. Molecular quality as kDa 26, with 238 amino acids, 65 ~ 67 of amino acid (Ser-Tyr-Gly) form shine group, is mainly the position of the light. The light the formation of the group has no species specificity, a fluorescent stability, and does not need to rely on any auxiliary factors or other matrix and shine. Green fluorescent protein gene into the host cell is stable, for most of the host physiology no effect, the report is a common gene. This paper reviewed the green fluorescent protein discovery process, basic properties, application and development prospect.
Key words
Green fluorescent protein；Report gene；Drug screening；Fusion antibody
1 GPF的发现
2008年的诺贝尔化学奖授予从事有关:“绿色荧光蛋白( GFP) 的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：日本科学家下村修（Osamu Shimomura）；美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）。绿色荧光蛋白( GFP) 是一种在维多利亚多管水母体内所发现的蛋白质。是在1962年由下村修等科学家发现。而水母所发出的绿色荧光,并非由GFP发出,它是因照相中所使用闪光的反射所致。
2 GFP的结构及发光原理
2.1 GFP的结构
由维多利亚多管水母中发现的GFP是一种化学性能稳定的小分子蛋白质，由238个氨基酸残基组成。在蓝色波长范围的光线激发下，发出绿色萤光。GFP的原初结构式通过氨基酸残基65-67(Ser-Tyr-Gly)而生成的荧光发色团(Cody et al，1993)。在GFP的65-67(Ser-Tyr-Gly)可自发的形成一种P-羟基亚苄基咪唑酮的荧光发色团（如图1所示）。
图1 发色团
GFP的晶体结构是11个β-折叠组成的β-桶状结构组成的二聚体，在桶中央有一个α-螺旋。β-
桶状结构直径约3nm，高约4nm。β-折叠彼此紧密结合，像桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带（如图2所示）。桶状结构和位于其末端的短α-螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点（Yang F et al，1996）。蛋白的一级结构大部分用来形成β-折叠和α-螺旋。蛋白质原初结构中,很大一部分用于构筑β-管道，以及线状的α-螺旋体。在能保持GFP荧光发射的条件下，从GFP的N2端和C2端可以除去的N2端残基和C2端的残基(总数达230～238) 是无序的（吴世康，2008）。
图二 GFP的晶体结构
2.2 GFP的发光原理
GFP的激发光谱在400nm处有一主要激发峰，在470nm处有一次要激发峰，发射光谱在505nm处有一尖锐的主要发射峰，在540nm处有一肩峰。这一结果是于1998 年,由Tsien所测得。
GFP的性质和发射光谱的稳定性与其生色团结构的稳定性紧紧相关。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使得66位氨基酸残基的α，β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化成稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团（吴沛桥等，2009）。GFP 的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要氧使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射（徐飞虎和龚兴国，2002）。
3 GFP在生物技术中的应用
3.1 GFP作为报告基因
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测（吴沛桥等，2009）。
常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ ,是利用酶促催化反应,需要加入外源底物和诱导物(如IPTG,X-gal) ,不仅操作繁琐且价格昂贵。现已构建了以GFP S65 T 基因作为筛选标记的新型克隆载体,建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法（孙德惠等，2006；范学政等，2005）,替代LacZ 蓝白斑筛选,不需X-gal ,经济简单可行。
作为一种新的报告基因，GFP在生物学研究中得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机原理，可将GFP作为蛋白质标签，利用DNA重组技术将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，所以将其和其他蛋白融合不会影响自身发光。1996年，Ehrdardt等人首次报道利用GFP研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成一个环状物，并且至少有9种蛋白在细胞分裂中起到重要作用，虽然对这些蛋白功能并不是很清楚，但是利用GFP已经搞清楚他们聚合的顺序及蛋白定位中的一些特征。除了用于蛋白的标记定位之外，GFP也可以大量用于细胞器的标记。