CD4细胞内因子检测试剂盒说明书

CD4细胞内因子检测试剂盒步骤
一.样本收集准备
血样收集要使用肝素钠及其他抗凝剂以中和淋巴细胞作用。

使用前可放于室温条件避免血小板活化，收集后8小时内使用！长时间存放可影响抗原提呈细胞功能，运输也可合并细胞功能丧失。

二.步骤
1.标记2只15ml聚丙烯活化试管：
1管：加入0.5ml肝素化全血，稀释后的刺激剂PMA（取5ul 8×分装以1×PBS 35ul稀释至总体积40ul）和INOMYCINE（取2ul 4×分装以1×PBS 6ul稀释至总体积8ul）各1ul，5ul CD28/CD49d单克隆抗体混合物。

2管：加入0.5ml肝素化全血，5ul CD28/CD49d单克隆抗体混合物。

轻轻振荡每只试管，然后37°孵化2小时。

注意：离心管盖子拧松！！
2.从冰箱取出一只分装好的BFA，以消毒的1×PBS 1:10稀释（加90ul1×PBS稀释至总体积100ul），每管加入稀释液10ul，振荡，然后37°孵化4小时。

注意：离心管盖子拧松！！
3.每管加50ulEDTA的PBS溶液，剧烈振荡，室温孵育15分钟，再次最高速振荡10秒。

4.如果细胞马上用来染色，可参照4a执行；如果是冻存待染，参照4b。

4a：
•标记4只聚苯乙烯试管
1管：活化的同种型对照（AIC）
2管：未刺激同种型对照（UIC）
3管：活化样本（AS）
4管：未刺激样本（US）
•往AIC管和AS管各分装100ul活化全血
•往UIC管和US管各分装100ul未刺激全血
•接第5步。

4b：
•每管0.5ml全血样本（已活化和未刺激）均加5ml 5 mL of 1X BD FACS Lysing Solution (使用前用去离子水1:10稀释)
•振荡，室温孵育10分钟，直接放入-80°冻存。

•染色时，37°水浴箱简单溶解细胞，加入7ml wash buffer，500G室温离心10分钟。

•去上清，以0.5mlwash buffer 重悬沉淀颗粒。

准备染色时
•标记4只聚苯乙烯试管，此同4a操作。

•接第7步。

5.每管加入1ml 1X BD FACS Lysing Solution (使用前用去离子水1:10稀释，每个样本需取
400ul 10×BD FACS Lysing Solution加去离子水3.6ml稀释至4ml)，轻轻混匀，室温孵育10分钟。

6.每管加入2ml wash buffer ，500G室温离心5分钟（可尝试800G 6-7min）。

7.弃上清，每管加入0.5ml1X BD FACS Permeabilizing Solution 2(使用前用去离子水1:10稀释，每个样本需取200ul 10×BD FACS Permeabilizing Solution 2加去离子水1.8 ml稀释至2ml)。

振荡重悬沉淀颗粒，室温孵育10分钟。

8.每管加入2ml wash buffer ，500G室温离心5分钟（可尝试800G 8min）。

9.弃上清，
AS和US每管加入20ulBD FastImmune anti-cytokine FITC/CD69 PE/CD4 PerCP-Cy5.5，5ul AF647 T-BET抗体，5ul PE-CY7 IL-4 抗体；
AIC和UIC每管加入20ul BD FastImmune γ2a FITC/γ1 PE/CD4 PerCP-Cy5.5 isotype control ，5ul AF647 T-BET和5ul PE-CY7 IL-4 同型对照。

避光室温孵育30分钟。

10.每管加入2ml wash buffer ，500G室温离心5分钟（可尝试800G 8min）。

11.弃上清，加入200ul 1%多聚甲醛的PBS溶液，振荡重悬沉淀颗粒，流式分析前避光4°存放（可在冰层上放一泡沫盒，防止细胞悬液结冰，破坏细胞），须在24小时内完成流式分析。

注意：已固定及透化处理好的细胞比活细胞更具漂浮特性，需要更大的离心力来使其沉淀，为避免细胞丢失，建议弃上清时以倾泻法替代抽吸法进行。