超低温保存技术的相关机理综述
低温保存技术在生物制品中的研究进展
生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 547 ~ 555
Current Biotechnology ISSN 2095‑2341
进展评述
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低温保存技术在生物制品中的研究进展
刘容麟1 ， 王宁2 ， 李岩异1 * ， 张卫婷1
1.华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄 050035；
2.石家庄农业技术推广中心，石家庄 050000摘
要：生物制品在储存中易发生多种物理和化学降解，因此生物制品长期保存技术对于减缓生物制品降解、保持生物
活性、延长储存期限十分必要。目前，低温保存技术是生物制品长期保存最常用且有效的方法，其能极大地减少生物制品储存时，由于液态水带来的多种物理降解和化学降解导致的活性降低现象。然而低温保存技术在生物制品的保存过程中仍会发生损伤，这些损伤包括冰晶损害、冰水界面吸附变性、渗透伤害等，使用合适的冷冻工艺和冷冻保护剂（cryoprotectant agents, CPAs ）对减少低温保存过程带来的负面影响有重要作用。综述了低温保存技术在生物制品保存过程中的研究进展，包括低温保存的影响因素（冷冻保护剂、冷冻过程和其他影响因素）以及最新的低温保存技术，以期为生物制品在长期保存过程中克服损伤和维持活性提供参考。关键词：冷冻；低温保存；冷冻保护剂；冻融DOI ：10.19586/j.20952341.2023.0045 中图分类号：TQ464 文献标志码：A
Reasearch Progress of Cryopreservation Technology in Biological Products
超低温在牧草种子保存中的作用
ｔｏ ｅ ） 件 下 保 存 ， 此 超 低 温 保 存 又 称 液 氮 保 行保 护性 脱 水 ， ｒｇ ｎ条 因 阻止 冰晶生长 ， 而使 之较 易达 到玻 从 存， 这种 方法 是将 种质 材料 （ 包括种 子 、 组织体 等 ） 保 璃 化状 态 。液体 固化 成 玻 璃 体 ， 际 上 还 是液 态 存 实
细胞质 溶 液“ 固化 ”细 ， 变 的可 能性 降低 到 最 低 限度 ， 样可 长 期 的 保 持 细 死亡 。但 如果 降温 速度很 快 ， 这 胞 的遗 传稳 定性 。超 低温 保存 能长 期 、 全 、 安 稳定地 胞 内形 成 对 细胞 不 致伤 害 的微 小 冰 晶或仍保 持非 结
人们越来越关注作为植物种质资源主体的种子的长 理 想 的方法 ， 植物 种 质 的长 期保 存 上 逐 渐 显示 出 在
期保 存 。种 子贮 存是 物种 多样 性 和遗传 多样性 保 护 其 不 可替 代 的优 越性 。 的重要 手段 ， 它不 仅有 利 于品种 资源保 存 ， 还可 防止
与 饲料 ２ ０ ０ ８年 第 ８
论 综 述 ．３ ９．
内结 冰 ， 而达 到超低 温保 存效 果 。 从
植物种质资源超低温保存的研究进展
l和 J
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t１８ 认 为 玻 璃 化 冷 冻 是 一 种 技 术 上 简 单 的 植 物
种质超低温保存方法,只需使用合适的超低温保护剂和快速降温,甘薯茎尖在玻 璃 化 诱 导 预 处 理 后,在 液 氮
(－１９６ ℃ )下存活;在生长培养基中,用含有 质 量 浓 度 ３００g/L 甘 油、质 量 浓 度 １５０g/L 乙 二 醇 和 质 量 浓 度
芽和根;对照组与超低温保存组在芽 长、叶 形、叶 宽 长 比、根 长 等 形 态 特 征 上 无 显 著 差 异(
P ＜０．
０５);冻 后 再
生苗叶片不定芽的再生速度和频率 与 未 冻 对 照 相 同;对 照 组 与 超 低 温 保 存 组 可 溶 性 蛋 白 和 POD 同 工 酶 电
泳谱带无明显差异;
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on)是植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后进行
yop
液氮保存的方法 [１４].其基本程序是:预 培 养、体 积 分 数 ６０％ PVS２(
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on,MS ＋ 质 量
超低温保存果树种质资源研究进展
在离体培养技术基 础 上发展起 来 的缓 慢 生长法 和 超低温保 存法保存技术 ， 以其无菌 培养 、 占用空 间少、 动力和维持 开 劳
支少等 优点克 服 了常规 保存 中难 以克服 的问 题 。缓慢 生
液氮保存 。 预 培养法为将 待保存材料 在含 有冷冻 保护剂 （ 如二 甲基 亚砜 、 蔗糖 、 聚乙二醇等 ） 的培养基上 预培养一 段时间 以诱导
１ ２ 不 需要程控 降温仪的超低 温保 存法 ．
１８ Ｉ ｓ ９９年 丑 等和 【 口ｌ 首 次报 道玻 璃 化保 存法 。 『 Ｉ等 ｒ ｌ ｉ
一
般程 序为 ： 待 保存 材料 首 先用 冷 冻保 护 剂 进行诱 导脱 将
水， 然后用冷冻保护剂 进行 处理 ， 最后 将 其直 接 爱人液氮 保 存 。依 据的原理 为 ： 在此条 件下 ， 整个冻存 系统 快速降温 ， 以 玻 璃态存在 ， 不形成 冰 晶。玻 璃态 的物 质结 构、 而 组成成分 可长期 不变 ， 从而达到长期保存 待保存材料 的作用 。在果树
诱导脱水 ， 然后用 冷冻保 护剂 进 行处理 ， 后将其 直 接爱人 最
程 控降温仪 价格 昂贵 ， 限制了需 要程控降温 仪的超低 温 保存法 的使用范围 。研究表明 ： 部分植物可忍 受较大 范国 大 内的降温速度 ， 如在 ０ ５ ～２Ｃ ｍｎ 间。据此 ， ． ＂ ｌ ｉ之 出现 了简 化控 速超低 温保 存法 、 预培 养法 、 干燥法 、 预培 养干燥法 、 包 埋 干燥法 、 玻璃化 保存法和包埋玻 璃化法等各 种超低温 保存
种质资源的超低温储藏研究进展
［ ］ 北京 ： Ｊ． 中国林业科学研究院 ， ０ ． ２ ０ ０
［ ７ 庄瑞林 ， １］ 陈炳章． 中国主要油茶物种 的脂 肪酸含量［ ］ 植物生理 Ｊ．
学 通 讯 ，９ ５ ２ ：６ ２ ． １ ８ （ ）２ － ８
（ 责任编辑
葛华 忠）
种质 资 源 的超 低 温 储 藏 研 究 进 展
［］ ９ 刘子 雷 ， 水 平 ， 小 华 ， ． 江红 花 油茶 果 实形 态 变异 研究 杨 姚 等 浙 ［ ］ 林业科学研究 ，０ ７ ２ （ ） ２ ３ ２ ６ Ｊ． ２ ０ ，０ ２ ：６ — ６ ．
［ Ｏ 刘子雷 ， １］ 姚小华 ， 杨水平 ， 浙江红花油 茶果 实经济 性状变异 的 等． 研究 ［］ 西南 大学学报 ： 然科学版 ， ０ ．９ ４ ： — ８ Ｊ． 自 ２ ７ ２ （ ）８ ８ ． ０ ３ ［ １ 国家油茶科学中心． １］ 油茶高效实用栽培技术 ［ ． Ｍ］ 北京 ： 出版 科学
［４ 庄瑞林 ． １］ 油茶低产林改造 ［ ． Ｍ］ 北京 ： 北京科 学普及 出版社 ， ９ ． １ ９ ９ ［５ 康志雄 ， １］ 邹达 明． 世界 山茶研究现状及 发展趋势 ［ ］ 浙江林业 科 Ｊ．
技 ，９ ８ ８ １ ：５－９ １８ ， （ ） ４ － ． ４
［６ 田朝光 ． １］ 普通 油 茶重 要 经 济性 状 及 脂 肪酸 组成 遗 传 变异 研究
生物材料
超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的 准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、 准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活 力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 力和变异的评价、植株再生等几个步聚。 一、玻璃化保存方法 二、传统的降温冰冻方法 三、其它超低温冻存方法
二、玻璃化保存方法 玻璃化是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 玻璃化是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率； 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加 溶液浓度。 溶液浓度。 1．玻璃化法 ． 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后， 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直 接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变， 接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入 玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶， 玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构 和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后， 和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保存终止后，复温时 要快速化冻，防止去玻璃化的发生。 要快速化冻，防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻 两个关口，就可保证冻存的成功。 两个关口，就可保证冻存的成功。 2．包埋玻璃化法 ． 包埋玻璃化法是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。 包埋玻璃化法是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋， 保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶 液处理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋—脱水法要 液处理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋 脱水法要 可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。 高，可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。
低温物理学与超低温技术
低温物理学与超低温技术
低温物理学是研究物质在极低温下的性质和行为的学科，而超低温
技术则是应用低温物理学的知识和技术手段，实现极低温条件下的科
学研究与工程应用。本文将对低温物理学和超低温技术进行综述，并
探讨其在科学研究和技术应用中的重要作用。
一、低温物理学的基本原理
低温物理学主要研究物质在接近绝对零度时的性质和行为。根据研
究的温度范围，可以将低温划分为常规低温、极低温和超低温。常规
低温范围一般指液氮温度以下（77 K），极低温范围一般指液氦温度
以下（4.2 K），而超低温则一般指液氦温度以下的更低温度条件。
低温下，物质的性质将发生显著的变化，如电阻变小、电导率增加、磁性增强等。这些变化使得低温物理学在研究超导、超流、低温物态
等领域起到了重要作用。同时，低温物理学也为超低温技术的发展提
供了理论和实验基础。
二、超低温技术的发展与应用
超低温技术是通过降低温度，实现物质的超低温储存、传输和实验
研究的技术手段。目前，液体氦是最常用的超低温工质，其沸点为4.2 K。超低温技术的发展离不开低温制冷机的提升性能和新型材料的发现。
超低温技术在科学研究中广泛应用。例如，在凝聚态物理学中，超
低温技术被用于研究超导、超流、低温固态物理、低温等离子体等现象。在量子信息领域，超低温技术为实现量子比特的创建和控制提供
了基础。此外，超低温技术还用于研究高温超导的机制、冷原子物理
学等新兴领域。
超低温技术在工程应用中也有广泛的运用。例如，在医学领域，超
低温技术被用于生物细胞的冻存和保存，以及器官的移植保存。在航
天工程中，超低温技术则被用于液氢和液氧的储存与输送。另外，在
种质离体保存
➢培养基:一般就是保存前使用得培养基,但有时需将大量元素或
琼脂含量减半,或在培养基中附加一定量得PVP、水解酪蛋白等,以 利于材料得恢复生长。
37
六、超低温保存中变异及其检测
保持原有种质得遗传稳定性,就是种质保存得基本要求。 ➢超低温保存得遗传变异属于体细胞变异。 ➢变异与起始细胞得生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等 有关(变异基本上都就是在非超低温下产生得)。 ➢在保证保存材料活性得同时,应尽量采用减少变异得方法技术。
30
三、冰冻保护剂得应用
冰冻保护剂(Cryoprotective agent,CPA)也称抗冻剂,为植物 低温保存必不可少。 ➢特点:易溶于水,对细胞无毒害,容易从组织或细胞中清除。 ➢作用:增加膜透性,加速细胞内水流到细胞外结冰;稳定细胞膜结构, 阻止低温伤害;降低冰点,提高溶液得粘滞性,阻止冰晶得生长。
6
超低温保存得优点:
➢ 在超低温条件下,活细胞内得物质代谢和生长活动几乎 完全停止,呈现“假死”状态。因此,细胞、组织和器官 在此过程中不会发生遗传性状得改变,也不会丢失形态 发生得潜能。
➢ 在超低温条件下,生命得代谢和衰老过程也基本停止,故 能够实现长时期得保存。
7
超低温保存得意义:
➢可以在有限空间内保存大量种质材料; ➢与种子保存相比,可以不受时间和种子含水量得制约; ➢与试管苗相比,可以避免频繁继代培养造成得变异,并大 幅度减少工作量。
第十二章植物种植资源的离体保存
冷冻防护剂得使用提高了培养基渗透压,导致细胞得轻微质 壁分离,相对提高了组织和细胞得抗寒力。
常用得冷冻防护剂
渗透型冷冻防护剂:
多为小分子中性物质,在溶液中易结合水分子发生水合作用, 使溶液粘性增加,弱化水得结晶过程,达到保护得目得。 包括 二甲基亚砜(DMSO)(极易渗入细胞内部,可防止细胞在 冷冻和融冰时,引起过度脱水而遭受破坏) 甘油 甘露醇 脯氨酸 乙二醇 丙二醇
细胞冰冻结冰保护性脱水理论
常温下,细胞及其溶液处于渗透平衡得状态,当温度降到冰点 以下时,首先就是细胞外溶液部分“冻结”出冰;胞外溶液得 浓度升高,破坏了细胞内外溶液得平衡,水分由胞内通过细胞 膜向外渗透,细胞收缩,细胞内浓度提高;当温度不断降低时, 冻结和渗透过程不断进行,这种过程称为保护性脱水。
而权银等(1989)在柑橘种质离体保存中对不同封 口材料得比较研究表明,封口材料以其透气性能影 响试管内气体成分,从而影响保存效果。
第二节 超低温保存
一、超低温保存概述
通常将-80℃以下得温度称为超低温。超低温冷冻 保存一般以液氮为冷源,使温度维持在-196℃。
植物材料超低温保存方法
植物材料超低温保存方法
摘要：
一、引言
二、超低温保存方法的原理
1.细胞膜的稳定性
2.细胞内生物大分子的稳定性
3.细胞器的稳定性
三、超低温保存方法的步骤
1.样本处理
2.低温预处理
3.快速冷冻
4.低温储存
四、超低温保存方法的优点
1.保存时间长
2.保存条件简单
3.保存材料活性高
五、超低温保存方法的适用范围
1.植物组织
2.动物组织
3.微生物
六、注意事项
1.低温设备的选用
2.冷冻速度的控制
3.储存条件的维持
七、结论
正文：
一、引言
随着科学技术的不断发展，植物材料超低温保存方法在生物学、农业科学等领域具有重要意义。这种方法可以长时间保存植物材料，保留其生物活性，为科学研究和农业生产提供了有力保障。
二、超低温保存方法的原理
1.细胞膜的稳定性：超低温保存方法可以保持细胞膜的完整性，避免细胞内容物泄漏。
2.细胞内生物大分子的稳定性：低温条件下，生物大分子如DNA、蛋白质等结构稳定，功能完好。
3.细胞器的稳定性：超低温保存方法有利于细胞器的结构和功能保持不变。
三、超低温保存方法的步骤
1.样本处理：首先对植物材料进行切片、涂片或粉末处理，以便于后续操作。
2.低温预处理：将处理好的样本放置在4℃条件下，进行低温适应。
3.快速冷冻：将预处理好的样本迅速置于液氮中，快速降低温度。
4.低温储存：将冷冻后的样本放入-196℃的液氮中，长期储存。
四、超低温保存方法的优点
1.保存时间长：超低温保存方法可以延长植物材料的保存时间，有利于长期研究。
2.保存条件简单：只需低温设备和液氮，无需复杂设备和技术。
3.保存材料活性高：低温条件下，细胞器和生物大分子保持活性，有利于后续实验研究。
超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展
超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展
超低温冷冻技术是一种将细胞或组织冷冻保存，并在需要时重新恢复其功能的技术。随着人们对海洋资源的逐渐开发利用，对于鱼类精子保存的需求也日益增加。鱼类精子是一种重要的遗传资源，能够广泛应用于种质资源保存、育种以及人工繁殖等领域。研究如何高效保存鱼类精子具有重要的理论和实际意义。本文将对超低温冷冻技术在鱼精子保存方面的研究进展进行综述。
超低温冷冻技术是目前保存鱼精子最常用的方法之一。该技术可以将鱼精子的新陈代谢减缓到极低的水平，从而实现鱼精子的长期保存。超低温冷冻技术的关键在于使用低温介质将鱼精子迅速冷冻至极低温度，并采用适当的保护剂保护鱼精子的完整性与生活力。目前，业界广泛使用的保存鱼精子的超低温冷冻介质是液氮。液氮的温度非常低，可以迅速冷冻鱼精子。添加适当的保护剂，如甘油、DMSO等，可以保护鱼精子的细胞膜完整性和功能。通过这种方法保存的鱼精子可以在液氮中保存多年，且在需要时可以快速恢复其活力。
超低温冷冻技术在鱼精子保存中还存在一些技术难题。超低温冷冻过程中鱼精子的冻结速率对保存效果有着重要影响。过快的冻结速率会导致鱼精子内部的水结晶过程太快，从而导致细胞膜破裂。而过慢的冻结速率则会导致冰晶生长过程中会损伤鱼精子细胞内部结构。超低温冷冻过程中鱼精子的解冻过程也会对保存效果产生影响。解冻过程中，如果温度变化过快或者压力变化过大，都会导致鱼精子细胞膜破裂，从而降低保存效果。超低温冷冻对鱼精子活力的影响也是一个难题。超低温冷冻过程中，尽管可以将鱼精子的新陈代谢减缓，但仍然会对鱼精子的细胞膜、染色体和线粒体等结构产生一定的损伤。
植物种质资源设施保存研究进展
植物种质资源设施保存研究进展
摘要植物种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式。设施保存是当前最有效、最安全的保存方式, 它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法。文中综述了植物种质资源设施保存3种方法的原理与技术特点, 设施保存技术在植物种质资源保存中的应用, 以及当前研究的热点与发展趋势。
关键词设施保存低温保存超低温保存种质离休保存植物种质资源
植物种质资源保存主要有原地保存、异地保存
和设施保存(设备保存、离体保存)3种方式。原
地保存是指在植物资源丰富的地区建立自然保护
区、原地保存林等,以保护植物种质资源及其生境;
异地保存是指当天然群体的遗传组成发生严重的变
化, 或存在潜在破坏威胁的物种, 在植物种的非本地
群体中收集种子或繁殖材料, 营建异地保存林(圃)
进行集中保存; 设施保存, 也叫设备保存、离体保存,
就是利用种质资源库(冷藏库、超低温库、组织培养
室)等保存设施长期保存种子、配子体、器官、组织、
细胞等种质材料, 来达到保存植物种质资源的目的,
它也可以被看作是异地保存中的一种形式。设
施保存可以大批量贮藏种质材料于一个较小的可以
人工控制的空间, 并能安全地保存种质30～50年以
上, 具有种质不易丢失、便于交换和利用等特点, 是
一种行之有效的保存方式。
世界自然保护联盟(IUCN)在1978年出版的
《植物红皮书》一书中指出: 在全世界分布的约25万
种维管束植物中, 估计约有2万～2.5万种(占整个
区系成分的10%)处于很稀少或受严重威胁的状
况, 这意味着人类赖以生存的植物资源陷入了生
超低温制冷技术研究及其在航天工程中的应用
超低温制冷技术研究及其在航天工程中的应
用
超低温制冷技术是一种涉及到温度极低的方法，其在物理、航空航天、医学等
领域中具有广泛的应用。航空航天工程中，超低温制冷技术是一项重要的技术，可以实现高精度的任务和载荷，例如卫星对地观测和深空探测等。本文将从超低温制冷技术的基本原理、常用的超低温制冷技术、航天工程中的应用以及未来发展方向等方面加以综述。
一、超低温制冷技术基本原理
超低温制冷技术基于制热制冷原理，利用压缩空气或者过冷制冷剂产生低温，
并将低温传导到冷却体上。超低温制冷技术的原理是利用制冷剂的物理性质，将其从高压到低压，使其从气态到液态，从而吸收热量。通过连续压缩和膨胀制冷剂，可以将温度降至极低。
二、常用的超低温制冷技术
1. 液氮制冷技术
液氮是一种常见的制冷介质，可以制造出非常低的温度。液氮的沸点为-196°C，因此它可以对航空航天领域的设备和载荷进行高精度的冷却。
2. 液氦制冷技术
液氦是一种超低温制冷剂，其沸点为-269°C。液氦不会引起任何化学反应并减
小了热噪声。它在超导介质、红外探测器、低温物理学、医学、分子生物学、半导体研究等领域中得到广泛应用。
3. 声波制冷技术
声波制冷是一种新型的超低温制冷技术。其原理是利用声波产生的变压差来冷却物体，可以实现对磁共振成像等高灵敏度设备的高效制冷。
三、航天工程中的应用
超低温制冷技术在航天领域中应用非常广泛。例如，卫星对地观测需要大面积的高精度光学镜头，透镜组件的制冷就需要超低温制冷技术。同时，行星探测器和深空探测器对环境温度和热噪声的抗干扰能力要求非常高，超低温制冷技术可以保证设备在任何复杂环境下都能运行可靠。
微生物液氮超低温保存研究进展
微 生 物 液 氮 超 低温 保 存 研 究 进 展
王 华 杜 立 业 李 华 ’ 一， ～， 。
（ ．西 北农 林科 技 大 学 葡 萄 酒 学 院， 西 杨 凌 ７ ２ ０ ；．陕 西 省葡 萄 与葡 萄 酒 工 程 技 术研 究 中 １ 陕 １ １０ ２
心 ， 西 杨 凌 ７２０ ） 陕 １ １ ０
在 的 一 些 问题 。
关 键 词 ：液 氮 超 低 温 保 存 ； 酸 菌 ； 母 菌 ； 藻 类 ； 生 动 物 乳 酵 微 原
中 图 分 类 号 ： ９ － ３ Ｑ ３ ３ ６ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｙ ｐｒ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｉ ｒ ｏ ｇ ｎｉｍ ｎ ｑｕ ｄ Ｎｉｒ ｇ ｎ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｃｒ ０ ｅ ｅ Ｖ ｔＯ ｆ Ｍ ｃ ｏ ｒ ａ ｓ ｉ Ｌｉ ｉ ｔ ｏ ｅ
ｍｏ ｔ ］ 究发 现 不 同 细胞 的低 温保 存 存 活率 与 冷 ｎ＿ 研 ８
却 速 度 有 关 （ １ 。 因 此 针 对 不 同 微 生 物 需 要 采 用 图 ）
保持 其原 有的代 谢活性 ＿ ３ 引。
１ １ 冷 却 过 程 中 细 胞 受 损 伤 的 两 因 素 假 说 ．
Ｃｅ ｅ ｏｒＶ ｉｉＶ ｉ ｃ ｔ ｅ， ａ ｇｌｎｇ ７１ ００，Ｃｈｉ ） ｎｔ ｒｆ ｔ— ｎｉｕｌｕｒ Ｙ ｎ ｉ ２１ ｎａ
花粉超低温保存研究进展
参考内容
植物种质资源是生物多样性的重要组成部分，对于生态、农业和遗传学等领 域的研究具有重要意义。然而，由于环境变化、人类活动等多种因素的影响，许 多植物种质资源面临着濒临灭绝的风险。超低温保存技术作为一种有效的种质资 源保存方法，可以通过将植物组织或器官保存在极低温度下，使植物保持其原有 的遗传特性和生物活性。本次演示主要综述了植物种质资源超低温保存技术研究 进展。
花粉超低温保存研究进展
目录
01 引言
03
影响超低温保存效果 的因素
02
花粉超低温保存的基 本原理
04
花粉超低温保存的研 究进展
目录
05 花粉超低温保存的应 用前景
07 参考内容
06 结论
引言
花粉作为植物繁殖的重要媒介，对于维护生态平衡和农业生产具有重要意义。 然而，花粉的活性会受到环境、气候、植物健康状况等多种因素的影响，从而影 响植物的繁殖与生产。为了解决这一问题，研究者们尝试利用超低温保存技术来 长期保存花粉。这种技术的基本原理是将花粉置于极低的温度下，使其进入休眠 状态，从而有效延长其保存时间。本次演示将综述花粉超低温保存的研究进展， 以期为未来的研究提供参考。
花粉超低温保存的基本原理
超低温保存技术是一种基于低温生物学原理的方法，其基本原理是利用极低 温度（如-196℃）使生物体进入休眠状态，从而有效延长其保存时间。在这种状 态下，生物体内的活性物质和代谢过程得到抑制，从而避免了常规保存方法中出 现的腐败、变质等问题。对于花粉的超低温保存，一般采用液氮（LN2）作为冷 却剂，将花粉悬浮液直接置于液氮中，使其处于超低温状态。
超低温处理植物脱毒研究ppt课件
注：AD：顶端分生区；1-5：第一 到第五叶原基；图 中紫色部分显 示SPCSV侵染区域。
注：A：未经超低温处理的茎尖； B：超低温处理 后，经过一天复苏 培养的茎尖；AD：顶端分生区； LP1： 第一叶原基；LP2：第二叶 原基；箭头所指为细胞核清 晰可 见的活细胞。
5
超低温处理的优势
• 脱毒率不受茎尖大小的限制，操作简便易于推广 。茎尖剥离受到茎尖大小的 限制，存在脱毒率与成 活率之间的矛盾。茎尖越小脱毒率越高，但是成活率 越低；反之亦然。无论茎尖取的大还是小，能够在超 低温处理后存活的细胞 都只是顶端分生组织细胞和 部分叶原基细胞，所以超低温处理不受茎尖大小 的限 制。
理论上只要能利用超低温保存保存种质的植物都可以用超低温处理进行脱毒经超低温处理成功脱毒的健康植物材料还可以利用实验筛选得到的超低温保存条件进行健康种质的长期保存从而避免因长期组织培养造成的变异
超低温处理植物脱毒研究进展
演讲人 XXX
;.
1
文章综述
• 植物病毒素有植物癌症之称，在植物体内通过微 管组织和胞间连丝进行 扩散，干扰植物的新陈代谢、 降低作物的产量和品质、甚至导致植物死亡。 但农作 物感染病毒的现象非常普遍，自从1892 年俄国微生物 学家Dimini Iwanowsky 发现烟草花叶病毒以来，人类 发现的植物病毒已多达近千种。 全球每年因植物 病毒造成的经济损失约600亿美元。植物病毒已成 为降低农 作物产量和质量的主要因素之一。 Brison 等 人 于 1997 年 利 用 超 低 温 处 理 （Cryotherapy）成功脱除李痘病毒（PPV），脱毒率50%， 是茎尖 剥离脱毒率19%的2.5倍，标志着超低温处理 方法的确立。其后又经过多年 的发展，最终形成了现代的植物脱毒技术。 • 为 此，作者就超低温处理技术进行综述，以增加人们对 该技术的认识， 并对其应用前景进行了简要探讨。
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二甲基亚砜
二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
同时，氯化铬，氯化锰等过渡金属卤化物与氯化钾，氯化钠等卤化物在DMSO中有一定溶解度，故可以应用在有机电化学中。
二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。
DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。
DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。
DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤.
在防冻剂中的应用
纯DMSO 的冰点是18.45℃，含水40%的DMSO在-60℃不冻，而且DMSO与水、雪混合时放热。这种性质使DMSO可作为汽车防冻液、刹车油、液压液组分。乙二醇防冻液在超过-40℃低温时已不适用。而且比DMSO沸点低，有毒，易生产气阻。DMSO 防冻液在北部严寒地区用于除冰剂，涂料、各种乳胶的防冻剂，汽油、航煤的防冰剂，骨髓、血液、低温保存的防冻剂等。
在细胞冻存中的应用
二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。研究结果表明，培养液中DMSO 浓度为10%时，细胞生长抑制率近100%；1‰浓度时抑制率为35%，即使是0.04‰的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。
渗透性冷冻保护剂
渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是二甲基亚砜、甘油、乙二醇和丙二醇等。它们的主要作用机制是,与水结合后使溶液的冰点下降,使之不易形成冰晶;此类保护剂可稀释溶液中的溶质浓度,减少细胞摄取盐量,由保护剂替代;冷冻保护剂进入细胞,改变了细胞内过冷状态,使细胞内外压接近,降低了细胞脱水引起的皱缩程度和速度;此类保护剂进入细胞,缓解了复温时渗透性膨胀引起的损伤[3],起到冷冻保护作用。本试验采用不同浓度的二甲基亚砜、甘油、乙二醇对黑熊耳部成纤维细胞进行冻存研究,以期寻找最佳冷冻保护剂和最佳浓度。
PVS2溶液的组成：300g/L 甘油150g/L 乙二醇150g/L DMOS 0.4mol/L 蔗糖
PVS2由30%甘油(v/v),15%乙二醇(v/v),15%二甲基亚砜(DMSO,v/v)和0.4mol·L的蔗糖配成。
2PVS2溶液的组成：0.15mol/L 蔗糖液体培养基与PVS2溶液以体积比40:60 配制
装载(loading) 的过程, 即用一个较高浓度的冷冻保护剂混合液于室温下预处理一定时间, 以进一步降低组织含水量, 避免由于渗透压变化剧烈对材料所造成的伤害。
北海道大学指出：PVS2在处理中对细胞有毒害作用，稀释的装载液能够降低毒害作用，但是也导致了再生率的降低。用KF7G稀释PVS2溶液75%-50%可以降低装载过程中的毒害作用，还能保证再生率。
超低温保存(cryopreservation)被认为是一种有希望长期保存植物种质资源的技术,在液氮(-196℃)保存状态下活细胞的所有代谢几乎完全停止,可防止老化及变异(Nikishina 等,2001a)。超低温保存的冷冻方法分为快速冷冻法(rapid cooling)和玻璃化法(vitrification)等。快速冷冻法是指将材料直接投入液氮,此方法适合于含水量低、细胞小的材料。玻璃化法是利用高浓度的复合保护剂在25℃或者0℃下对材料进行预处理,投入液氮(Takagi,2000)。玻璃化液作用在于增大膜的通透性,促进脱水,降低水分冰点温度,保护蛋白质和酶类。目前广泛使用的玻璃化液为PVS2(plant vitrification solution 2)。
生物细胞在降温过程中，随着温度的降低，细胞外介质结冰，而细胞内尚未结冰，造成细胞内外蒸汽压力差。只要降温速率不超过脱水的连续性，细胞内的水不断向细胞外扩散，细胞原生质浓缩，从而降低细胞内含物的冰点，这种逐渐除去细胞内水份的
过程称为“保护性脱水”(Protectivedehydration)[31]o这种保护性脱水能有效阻止细胞质和液泡中结冰。但过度脱水会使细胞内有害物质积累，蛋白质分子之间形成二硫键，破坏蛋白质、酶，膜的完整性而受到伤害。“。此时，若降温速率加快(10℃／min以上)，细胞内就产生大量冰晶，导致细胞死亡。“。但是，如果降温速率非常快，细胞质溶液“固化”，但仍保持非结晶状态，这种现象称为“玻璃化”，对细胞不构成直接伤害。从理论上说，细胞内含物一旦发生玻璃化，就能避免细胞内结冰。
预培养的主要目的是使材料内的自由水含量减少以提高材料对低温的抗性，主要措施是将材料在添加高渗物质或低温保护剂的培养基上预培养，并在零度以上的低温下对材料进行低温锻炼，但预培养处理不是不可少的。
缓慢冷却过程则主要是诱导保护性脱水，以降低细胞的结冰点，一般采用两步法，材料在添加冰冻保护剂后，可用程控降温仪(约0．5-2℃／min)将样品降温至转移温度(一般为-40～-70‘C)，处理一定时间后再浸入液氮进行保存…’“1，降温速率、预冻温度及其停留时间等因素影响冻存效果。