Flow Jo软件分析细胞周期样品
2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
flowjo中文使用手册
flowjo中文使用手册摘要：一、FlowJo软件简介二、FlowJo中文使用手册的作用三、FlowJo基本操作流程四、FlowJo高级功能与应用五、FlowJo的优化与拓展六、软件使用注意事项七、结论与展望正文：FlowJo是一款流式细胞术数据分析和处理的软件，广泛应用于生物学、免疫学等领域。
FlowJo中文使用手册旨在为我国科研人员提供更便捷、高效的软件操作指导。
本文将详细介绍FlowJo的基本操作流程、高级功能与应用，以及优化与拓展方法。
同时，提醒用户在使用过程中注意一些关键问题，以充分发挥软件的优势。
一、FlowJo软件简介FlowJo软件由美国Dako公司开发，是一款功能强大的流式细胞术数据分析软件。
FlowJo能够满足科研人员在数据处理、分析、可视化等方面的需求，具有高度的灵活性和广泛的应用范围。
二、FlowJo中文使用手册的作用FlowJo中文使用手册为用户提供了一个详细的操作指南，帮助用户更快地熟悉软件功能，提高工作效率。
通过本文，用户可以了解到FlowJo软件的各项功能及实际应用场景，为科研工作提供有力支持。
三、FlowJo基本操作流程1.数据导入：将流式细胞术实验数据导入FlowJo软件。
2.数据预处理：对数据进行质量控制、筛选和归一化。
3.数据分析：利用FlowJo内置的统计方法和算法，对数据进行深入分析。
4.数据可视化：将分析结果以图表、堆叠图等形式展示。
5.结果导出：将分析结果导出为常用的文件格式，如Excel、TIFF等。
四、FlowJo高级功能与应用1.聚类分析：运用FlowJo的聚类算法，挖掘数据中的潜在规律。
2.机器学习：利用FlowJo内置的机器学习算法，对细胞亚群进行自动分类。
3.生物信息学分析：结合外部数据库，对细胞表面标志物进行功能注释。
4.动态追踪：实时监测细胞在实验过程中的变化，揭示细胞动态行为。
五、FlowJo的优化与拓展1.参数优化：根据实际需求，调整FlowJo软件的参数设置，提高数据分析效果。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
FlowJo分析细胞增殖
注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
flowjo说明书
FlowJo中文实用手册（软件版本：FlowJo7.6.5 2012/06/20 更新）第一章 FlowJo简介 (1)一、FlowJo对电脑配置的要求 (1)二、FlowJo的安装过程(Windows) (1)三、FlowJo的工作台 (5)第二章 FlowJo分析单标样本 (6)一、由原始数据生成单参数直方图的过程 (6)二、图形的输出和保存 (10)第三章 FlowJo分析多色标记样本 (13)一、由原始数据生成二维点图的过程 (13)二、二维点图的设门原则 (16)三、多色标记分析说明 (16)第四章 FlowJo软件荧光补偿 (18)一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤 (18)二、FlowJo荧光补偿的具体步骤 (18)三、双指数转换 (24)第五章 FlowJo的批处理功能 (27)一、设门分析的批处理 (27)二、表格分析的批处理 (32)三、图形分析的批处理 (35)第六章 FlowJo分析细胞凋亡样本 (43)一、细胞凋亡概述 (43)二、FlowJo分析凋亡数据的过程 (44)三、凋亡数据结果分析 (45)第七章 FlowJo软件分析细胞周期样本 (47)一、细胞周期分析概述 (47)二、FlowJo分析细胞周期数据的过程 (48)三、细胞周期拟合的调整方法和步骤 (51)四、细胞周期结果分析 (53)第一章 FlowJo简介FlowJo是美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室在90年代研发的一款流式数据分析软件。
FlowJo由于功能强大，简单易用，已经被领域内的科学家、实验室广泛引用；同时FlowJo也是各高影响力核心期刊引用最多的流式数据分析软件。
一、FlowJo对电脑配置的要求1. PC电脑：操作系统：Windows XP，Vista，Windows7内存：512MB及以上网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接；加密狗无需网络2. 苹果电脑：操作系统：OSX10.3或者更高版本内存：512MB及以上网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接加；密狗无需网络二、FlowJo的安装过程(Windows)•请到我们的网站上下载最新版本：/content/download在此，我们下载V7.6.5 为例/sites/default/files/7.6.5_X32.exe 将文件下载到桌面之后，就可以看到FlowJo安装程序图标。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤欧阳学文取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP 管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C——Flowjo软件分析FCMDNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。
FlowJo软件的简单介绍和基本应用
FlowJo软件的简单介绍和基本应用FlowJo是九十年代美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室研发的一款流式数据分析软件。
这款分析软件功能强大，操作简单，易学易用，可在Windows或者Mac系统下安装使用。
它简单直观的操作平台，已被领域内的科学家、实验室广泛使用。
同时，他也是各期刊杂志引用最多的流式数据分析软件。
一、FlowJo电脑配置及安装环境PC: 操作系统：Vista、Windows7内存：512MB RAM及以上MAC: 操作系统：OSX 10.3 或更高版本内存：512MB RAM及以上安装环境：避免阳光直射，水平放置，远离水源、热源二、FlowJo基本功能介绍1.阶梯式设门：将细胞群之间的逻辑关系用简单、递进的阶梯式去呈现，一改传统复杂的逻辑门设置。
并可以自定义细胞群名称，进而直观的显示细胞群统计值，让分析结果一目了然。
如图2.多种图像显示方法及显示类型：显示方法：它可以呈现为一维的直方图，二维图及三维立体图。
如图一维图二维图三维图显示类型:除了传统使用的散点图外，还有密度图，等高图，伪色图，斑马图等。
如图3..多种设门工具：设门是流式数据分析中界定细胞目标群的必要手段，不管检测的目标细胞群是规则分布还是不规则分布的，是小概率事件还是集体事件，都可以很方便的界定各种细胞群。
如图蜘蛛门四分门矩形门、椭圆门、自动门4.多种分析平台及工具：特殊的分析平台：细胞周期，细胞增殖，钙离子流量，反向设门等。
独特的分析工具：门的批处理，样品的荧光补偿。
5.灵活方便的数据导出：无论是图形数据还是表格数据都可以用Ofice软件、Powerpoint或直接打印，输出的表格数据可保存为HTML，SQL等格式。
三、FlowJo的基本应用：1.单标样本的分析方法：双击桌面Flowjo软件图标，进入软件工作台。
软件工作台由菜单栏、工具栏、组空间和样本空间组成（见图1）。
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期（PI染色）操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中，4℃冰箱保存，待测。
10、用流式细胞仪检测细胞周期
11、用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据，并导出细胞周期分析结果
备注：
1、RNase A：贮液浓度：1mg/ml ；
工作液配制：加1 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为20ug/ml。
2、PI：贮液浓度：2.5mg/ml；
工作液配制：加2.5 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为50ug/ml。
4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。
FlowJo软件的简单介绍和基本应用
FlowJo 软件的简单介绍和基本应用FlowJo 是九十年代美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS 机器的发明者）实验室研发的一款流式数据分析软件。
这款分析软件功能强大，操作简单，易学易用，可在Windows 或者Mac 系统下安装使用。
它简单直观的操作平台，已被领域内的科学家、实验室广泛使用。
同时，他也是各期刊杂志引用最多的流式数据分析软件。
一、FlowJo 电脑配置及安装环境操作系统：Vista、Windows7 PC:内存：512MB RAM 及以上MAC: 操作系统：OSX 10.3 或更高版本内存：512MB RAM 及以上安装环境：避免阳光直射，水平放置，远离水源、热源二、FlowJo 基本功能介绍1.阶梯式设门：将细胞群之间的逻辑关系用简单、递进的阶梯式去呈现，一改传统复杂的逻辑门设置。
并可以自定义细胞群名称，进而直观的显示细胞群统计值，让分析结果一目了然。
如图多种图像显示方法及显示类型：2.。
如图显示方法：它可以呈现为一维的直方图，二维图及三维立体图三维图一维图二维图，等高图，伪色图，斑马图等。
如图除了传显示类型:统使用的散点图外，还有密度图1．多种设门工具：3..的目标细胞群是规则分布设门是流式数据分析中界定细胞目标群的必要手段，不管检测便的界定各种细胞群。
如图还是不规则分布的，是小概率事件还是集体事件，都可以很方矩形门、椭圆门、自动门蜘蛛门四分门4.多种分析平台及工具：胞周期，细胞增殖，钙离子流量，反向设门等。
特殊的分析平台：细的批处理，样品的荧光补偿。
独特的分析工具：门灵活方便的数据导出：5.或直接打印，输出的表软件、Powerpoint 无论是图形数据还是表格数据都可以用Ofice SQL 等格式。
格数据可保存为HTML，的基本应用：三、FlowJo1.单标样本的分析方法：软件工作台由菜单栏、工具栏、组空间双击桌面Flowjo 软件图标，进入软件工作台。
Flowjo 7.6.1使用方法
Flowjo 7.6.1软件使用方法1.在桌面上建立新的文件夹，将需要分析的样本复制到文件夹内（一个文件夹内放一个指标的所有样本，便于统一操作）；2.运行软件3.将桌面上的新建文件夹拖入Flowjo内（Drag Samples Here）4两种方法处理以Th17细胞（CD4/FITC，IL-17A/PE）为例方法一：圈阳性细胞（更适用于两标记）设置阴性对照样本双击阴性对照样本（一般编号为001）出现以下窗口4.1依次单击T→Use Log Axis,横轴、纵轴同样操作，出现细胞4.2圈细胞：单击上面的正方形（或者椭圆或者四边形），在细胞上圈出较明亮的区域（无需更改命名）4.3双击以上所圈细胞，弹出另一窗口4.4选通道1：依次单击纵轴→Comp-FL1:: FL1 Log（1通道）依次单击横轴FS:FS Lin，出现以下窗口4.5圈CD4+T细胞细胞：用同样的方法在细胞群上方圈出CD4阳性区域），并命名为CD4，如下：4.6圈IL-17A阳性细胞：双击以上所圈细胞，弹出另一窗口。
用以上同样的方法圈出IL-17A阳性的T细胞，得到如下图以上便为阴性对照的设置过程（注：因此样本为阴性对照，须保证双阳（CD4+ IL-17A）比率均小于1%（或2%））5平行操作所有样本：将阴性对照的结果拖至上面的All Samples中，此时所有样本即被分析，如下：方法二：画象限设置阴性样本4.1同上4.2同上4.3同上4.4选通道1：依次单击纵轴→Comp-FL1:: FL1 Log（1通道）选通道2：依次单击纵轴→Comp-FL2:: FL2 Log（1通道）出现以下窗口：4.5画象限：如下注：保证双阳性区域值Q2小于1%（或2%）5平行操作所有样本：将阴性对照的结果拖至上面的All Samples中，此时所有样本即被分析，如下：（注：拖的是第一个样本标记的指标（CD4，IL-17A），而不是样本编号）若为三种标记如Treg细胞（CD4/FITC,CD25/APC,Foxp3/PE），也应该用画象限的方法：先设置通道1，双击阳性区域后，在弹出的新窗口内设置通道2和通道4，这样就可以画象限找出三阳性区域了。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C ——Flowjo软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。
11_流式分析方法
Flowjo 是现在最受欢迎的流式数据分析软件，由于它简朴易用并且十分有效。
则本文将其基本操作以及对细胞凋亡和细胞周期的 Protocol 分享给大家。
1.打开 Flowjo 软件双击桌面 FlowJo 软件图标，进入软件工作台。
或软件工作台由菜单栏、惯用工具栏、组空间和样本空间构成。
2.F lowjo 分析单标样本单标记样本数据惯用的显示方式是单参数直方图。
普通横坐标能够是线性标度或对数标度，代表着所检测的荧光或散射光的强度；纵坐标表达的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对比例来体现。
以 3 color comp 文献夹中的 CyPE comp.fcs 进行分析演示。
将此文献夹移至桌面，并把该数据文献夹从桌面拖入 Flowjo 中的组空间中。
在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的全部样本。
而后在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。
此为二维点图，X 轴选择 SSC（侧向散射，细胞内颗粒构造越复杂，质量越大，SSC 越大，反之越小。
）Y 轴选择 FSC（前向散射，细胞越大，FSC 越大；反之越小。
）选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中的任意一种，在二维点图中选中淋巴细胞。
在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。
在 X 轴选择 Cy5PE:CD4，Y 轴选择 Histogram，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一种，在单参数直方图中设门。
3.F lowjo 分析多色标样本多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。
横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一种点表达含有对应坐标值的细胞。
以三标记样本为例，选择 3-color-experiment 文献夹中的 931115-B02- Sample01.FCS 进行分析演示。
同样，在在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
/blog-349948-549703.html
张千 君
加为好友
给我留言
打个招呼
发送消息
（图一 ）
FlowJo分 析细胞周期数据 的过程
1. 把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)所示：
(图 二 )
X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。 2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三 ）所示：
构建全球华人科学博客圈 返回首页
RSS订阅 帮助
注册 | 登录
FlowJo中 文 技术博 客 分享
/u/FlowJo 流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训
博 客 首页
动态
记录
博文
相册
主题
分享
好友
留言板
个人资料
博文
Flow Jo软件分析细胞周期样品
细胞周期检 测的原理：
核酸染料可以与DNA分子特异性的结合，细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择 性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流 式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。 细胞周期示意图如（图一 ）所示
已有 1394 次阅读 2012-3-20 12:20 | 个人分类:FlowJo使用 | 系统分类:科研笔记 | 关键词:FLOWJO软件, 流式数据，细胞周期分析，
Flow Jo软件分析细胞周期样品
作 者 ： 胡 金涛
细胞周期的检测是流式细胞仪最为广泛的应用之一。细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代 分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始 RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于 G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质， 直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞， 这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期 区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪 进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤 病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
Archiver | 科学网 ( 京ICP备07017567 )
GMT+8, 2012-10-18 15:07
/blog-349948-549703.html
Page 3 / 3
通常来说，G2的位置为G1的2倍。 你可以根据相对固定的那个峰来确定另外一个峰的位置，如G1峰相 对固定的话，就选择G2峰的均数为G1的2倍(2G1)；如果G2峰相对固定的话，就选择G1峰为G2峰 的0.5G2
细 胞 周 期结 果 分 析 ：
4. 图三中各个区域的含义：
l G1期含义：细胞进行大量物质合成时期，为DNA合成做准备。 l S期含义：开始至完成DNA的合成以及合成组蛋白。 l G2/M期的含义：DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。
当的调整。
曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最 佳。拟和的好坏可以根据右边的RMS值来判断。RMS(root mean square)值越小越好。但是这只是 一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，选取最小值来达到最佳拟和。你可以选中G1期的峰或 G2期的峰，根据调节按钮调节峰的宽度
3. 在FlowJo工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞 周期”。 如（图四 ）所示
说明：
（图四 ）
1) 分析的模型有Watson和DJF两种，用户可以选择任意一种进行分析，两模型间没有实质的差别。模式
右边是两种模型的显示方式。
2) 细胞周期拟合原则：G1峰限制和G2峰限制。根据实验结果拟合情况，对G1峰限制和G2峰限制进行适
Page 2 / 3
（图五）
细胞周期FCS原始数据下载： 细胞周期A.LMD 细胞周期B.LMD
细胞周期C.LMD
本文引用地址：/blog-349948-549703.html
当前 推 荐数：0 推荐到博客首页
评 论 (0 个评 论) 数据加载中...
举报
分享
作者的其他最新博文
收藏 全部
该博文允许注册用户评论 请点击登录
• FlowJo分析钙离子流量 • 2012年9月 FlowJo讲座 郑州行程安 • 2012年10月 FlowJo讲座 杭州行程 • FlowJo分析细胞增殖 • 可下载流式学习资源（网络） • FlowJo应用常见问题及其解答
/blog-349948-549703.html
Page 1 / 3
（图三 ）
X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。本实验数据采集采 用的是贝克曼仪器采集的数据。（如果是BD的仪器采集的数据 ，X轴选择FL2-W,用来表 示PI的宽度 信 号。Y轴 选择FL2-A,用来表 示PI的 面积信号），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。
l Ploidy:倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量 但不排除染色体的异常。
l S期含量 :S期细胞占总细胞周期的比例。
细 胞 周 期数 据 结 果 输 出
6. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式
l 在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、 重新命名文件名以及文件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。
l 通常，根据G1期、S期 、G2期的百分含量来判断细胞周期的变化。相对于正常的细胞，加药 或 者 照 射 的细 胞 的 周 期 可 能会 发 生 变 。 一 般 根 据S+G2期 的 百 分 含 量 判断 处 理 后 的细 胞 是 促 进增 殖还是抑制增殖。
5. 细胞周期分析常用术语：
l CV：变异系数。不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此DNA含量的流 式分析中分辨率尤其关键。通常检测分辨率或精度由G0/G1峰的CV来反映。影响CV的因素主要 包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标本的人为影响。
热 门博 文导 读
• 母校召集校友回去祝寿，去还是不... • 深度剖析大漠孤魂 • 说说国内的人才计划---要领与到位 • 个人博客想写啥就写啥，读者不爱... • 科学网升级成官腔网啦？ • 在科学网写博为了什么？
Powered by Copyright © 2007-2012 中国科学报社