分子生物学作业

分子生物学作业一、名词解释1.断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区相互间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因成为断裂基因。

2.单核苷酸多态性单核苷酸多态性是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA 序列多态性。

是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。

单核苷酸多态性被认为是一种能稳定遗传的早期突变。

一、简答题1.简述真核生物基因组的结构与功能特点。

①真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体），有两份同源的基因组。

②真核生物的基因转录产物为单顺反子。

即一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。

③真核生物基因组存在重复序列，重复次数可达百万次以上。

④真核生物基因组中不编码的区域多于编码的区域。

⑤真核生物的大部分基因都含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因）。

⑥真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，具有多复制起始点，而每个复制子的长度较小。

2.试述双向凝胶电泳技术的基本原理。

双向凝胶电泳技术是指第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳与第二向SDS-PAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。

等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。

其中等电聚焦指：在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的PH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，待正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的PI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上，这种不同的蛋白质分别聚焦在各自的PI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象就称为等电点聚焦。

SDS-PAGE是在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。

SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。

蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。

蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，及蛋白质的分子量大小。

1.分子克隆技术包括哪些基本步骤？包括:①目的基因的获取;②载体的选择;③目的基因与载体连接;④重组DNA导入受体细胞;⑤重组体的筛选。

2.目的基因和载体连接主要有哪些方法？①粘性末端DNA分子的连接②平末端连接法③通过同聚尾连接3.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

①限制性核酸内切酶：能根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA 分子。

②DNA聚合酶：1. DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 DNA聚合酶Ⅰ5'→3' DNA聚合酶活性3'→5'核酸外切酶活性 5'→3'核酸外切酶。

Klenow 片段作用活性补齐双链DNA的3'末端，同时可使3'末端DNA标记上同位素。

cDNA克隆中，合成cDNA第二链。

DNA序列分析。

2.Taq DNA 聚合酶Taq酶具有5'→3'聚合酶活性和依赖于聚合作用的5'→3'外切酶活性。

3.逆转录酶反转录作用核酸酶Ｈ的水解作用依赖ＤＮＡ的ＤＮＡ聚合酶作用。

４．末端脱氧核苷酰转移酶在载体或目的基因 3'末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。

用于DNA 3'末端的同位素探针标记。

③DNA连接酶：能催化两个互补粘性末端双链DNA分子的5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA 连接起来。

④碱性磷酸酶：能除去DNA片段上的5’磷酸以防自身连接；在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上出去5’端的磷酸。

⑤T4多核苷酸激酶：既能连接粘性末端，又能连接平末端。

⑥核酸酶S1：可除去粘性末端以产生平末端，除去cDNA合成时形成的发夹结构，分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。

4.举例说明载体应具备的基本要素。

①能自我复制并具较高的拷贝数②分子量一般<10Kb③带有遗传筛选标记④有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选如pBR322质粒克隆载体，它是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA 重组技术构建而成的双链克隆载体，长为 4.36Kb。

它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。

在这两个抗性基因中分别含有BamH I和Pst I等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。

如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。

5.简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。

双抗生素筛选：某些质粒载体如 pBR322质粒中有Ampr和Tetr 抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets ）。

这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。

在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法蓝白班筛选：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段， IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。

当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。

6.有哪些常用的探针标记物？常用的探针标记物有：光敏生物素、生物素化补骨脂素、FITC和罗丹明、地高辛、[α32P]dNTP、[γ32P]dNTP、35S、3H、Bio-ll-dUTP、HRP和ALP。

7.如何进行探针的标记？缺口平移法、随机引物法、末端标记法、聚合酶链式反应。

8.影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？影响因素：1）核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。

探针长度应控制在50-300个碱基对为好。

2）温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较Tm值低25度。

3）离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度增加，杂交反应率增加。

高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

4）杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。

5）核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。

两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。

6）非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。

杂交条件的优化：1）探针的选择：检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针；检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针；长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体；100bp左右的探针适合原位杂交。

2）探针的标记方法：在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。

3）探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。

膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml；原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml 。

4）杂交最适温度：若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。

一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。

5）杂交反应时间：杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。

一般杂交20 h左右。

6）洗膜温度：杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行。

7）杂交液的优化：通常用于DNA杂交的标准杂交液为5*SSC，1.0%casein，0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%十二烷基硫酸钠。

必要时可以加一些杂交促进剂，常用的有硫酸葡聚糖，它能促进DNA链之间的缔合，10%硫酸葡聚糖存在时杂交速度可提高10-100倍，缺点是因其相对分子质量大会引起溶液黏度大大增加。

聚乙二醇（PEG）也是常见的杂交促进剂。

聚丙烯酸的钠盐，使用浓度为2%-4%，优点是粘稠度低，价格低廉。

一、名解1.生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。

常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

2.酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。

3.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

4.巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

5.Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

6.变性：模板DNA经加热至94℃左右5min聚合酶链式反应时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。