基于PCR技术进行侧翼序列分离的方法比较

基于PCR技术进行侧翼序列分离的方法比较
摘要利用PCR分离已知序列的侧翼序列是分子生物学相关研究工作中经常用到的技术。

本文综述比较了常用的热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等方法。

评估了各自的优缺点，旨在为研究者选择合适的技术解决相关问题提供依据。

关键词侧翼序列；TAIL-PCR；反向PCR；接头介导PCR
侧翼序列是指染色体特定位点两侧的DNA序列。

在现代分子生物学和微生物学研究领域，经常需要分离已知序列或位点的侧翼序列，对其进行分析或克隆，以研究基因的相关功能。

因此，侧翼序列克隆技术的发展应用越来越受科学研究者的重视。

目前，常用的分离侧翼序列的技术方法主要有：热不对称交错PCR （TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等。

本文重点介绍这三种PCR技术中具有代表性的方法，比较其各自的优缺点，分析其不同的适用范围，为研究者针对不同研究目的和需求选取不同方法提供参考。

1 热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）
1991年Parker等提出目标步行PCR，1993年Sarkar等报道了限制位点PCR。

这两种PCR技术均是通过设计一批随机引物，在退火阶段，使它们与已知序列的特异性引物结合，继而进行PCR扩增。

该方法由于操作复杂，在实际操作过程中使用很少。

随后，在此基础上进行改进，产生了一些新的方法，如热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）。

热不对称交错PCR技术是一种快速准确定位已知序列附近未知DNA序列的方法。

该技术的原理是依据已知序列设计3个具有高退火温度的嵌套特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3），依据蛋白质保守氨基酸序列设计一系列退火温度较低的简并引物（Arbitrary degenerate prime，简称AD），以基因组为模板，通过控制复性温度调节特异性引物和简并引物与模板之间的复性，进行3轮热不对称分级反应的PCR扩增，从而得到已知序列的侧翼序列。

2014年，本实验室利用该技术分离了Pseudomonas donghuensis HYST铁载体合成与调控相关基因[1]，目前仍在利用该技术分离P. donghuensis HYST对Caenorhabditis elegans的相关毒性基因。

在实验过程中，为了提高分离效率，将原PCR方法进行改良，主要有：①调整退火温度。

原TAIL-PCR方法中，高特异性退火温度为63℃，本研究中由于特异性引物的设计模板与原方法不同，退火温度进行了相应调整，根据Primer 5.0设定并优化最终定在56℃～58℃范围内。

②提高循环次数。

在实验过程中，为了大量积累目的片段，将原方法中超级循环次数进行相应增加，第一轮的12次超级循环提高至15次，第二轮的10次超级循环提高至12次。

③提高模板浓度。

原TAIL-PCR中利用前一轮产物的1000倍稀释物为模板进行后一轮PCR；本研究中则将前一轮产物的50倍稀释物作为模板，旨在提供高浓度的目的片段，有助于最后PCR产物回收时得到足够浓度的
目的片段。

④提高变性温度并延长变性时间。

由于，为了促进基因组完全解旋，在TAIL-PCR的三轮反应中，变性温度和时间相比于原方法均适当延长；此外，在第二轮反应中，特别增加了一次变性步骤。

如图1，将两种TAIL-PCR的反应条件进行比较：
2 反向PCR（inverse PCR，I-PCR）
反向PCR最早由Ochman等人报道，该技术通过一对反向引物扩增已知序列的上下游区域。

优点是，若限制性内切酶酶切位点设置合适，通过PCR可将已知序列的上下游序列都进行扩增。

但在实验过程中，DNA酶切片段的环化效率不高，PCR扩增效果依赖于酶切位点和已知序列之间的距离，若距离太长，PCR扩增效率则不高。

为了使长片段高效扩增，将该方法进行了优化。

3 接头介导PCR（Ligation-mediated PCR，LM-PCR）
接头介导PCR的原理是通过限制性酶切获得基因组DNA的酶切片段，继而与接头连接，再通过PCR等技术得到目的序列。

由于接头的不同，该方法分为多种。

下面重点阐述T接头PCR和A-T 接头PCR。

3.1 T接头PCR（T-Link PCR）
T接头PCR是在接头介导的PCR（LM-PCR）基础上优化的一种侧翼序列的分离方法，该方法最早在2003年由Yan 报道[3]。

T接头介导的PCR通过碱基T/A的互补配对取代随机配对使得扩增效率大大增高，该方法已经用来进行分离转基因植物T-DNA插入位点的侧翼序列。

3.2 A-T连接接头PCR（A-T linker adapter polymerase chain reaction PCR）
A-T连接接头聚合酶链式反应是基于接头介导PCR和T连接PCR发展出的用于分离已知DNA序列侧翼序列的技术，最早由Quoclinh Trinh等人在2012年发明并报道[4] 。

该方法针对T接头PCR重点进行了两方面的改良，其一，将接头进行了PO4和NH2修饰从而抑制了接头与接头形成非特异性产物的現象；其二，在基因组酶切片段的3’端额外添加一个脱氧腺苷酸，抑制DNA片段之间的自连，同时也解决了限制性内切酶位点克隆的偏好性。

经修饰后的接头和DNA片段能够形成T/A碱基的特异性配对，因此该方法的特异性，敏感性都很高，大大提升了普通接头介导PCR的效率。

2014年，Quoclinh Trinh[5]等人在A-T 接头介导PCR的基础上又发展出一个新策略，即将I-PCR或TAIL-PCR与A-T连接接头PCR相结合。

该方法相较普通的A-T接头介导PCR有两大特点，其一，模板为I-PCR或者RP-PCR产物，模板的复杂程度更低；其二，只需要进行一轮PCR扩增。

4 分析與展望
综上所述，每种方法各有优缺点，本文对上述的PCR克隆侧翼序列方法进行了综合比较并做出如下概括（表1）：①TAIL-PCR因其成本低廉，最适用于探究性实验，但其非特异产物却是不可避免的；②I-PCR适用于已知序列上下游区
域的分离克隆，但扩增效率与上下游片段长度相关，若要提高长片段的扩增效果，则需进一步改良；③T接头PCR中接头构造简单，受酶切位点限制不大，属于通用接头，利用A/T之间的碱基互补配对使得配对效率大大提升，同时减少了非特异性产物的生成，在克隆侧翼序列领域将得到广泛应用；④A-T接头PCR 进一步改造接头，使得该方法的特异性，敏感性都很高，大大提升了普通接头介导PCR的效率。

随着人类对生物体的进一步探索，TAIL-PCR，I-PCR，LM-PCR等技术在生物学不同领域发挥越来越重要的作用，科学家对侧翼序列分离克隆方法的探索也将不断进行，本文将目前已成熟的相关方法进行综述，希望能为科学工作者未来进一步探究发展侧翼序列克隆方法提供线索，为人类的生产和生活创造出更大的价值。

参考文献
[1] Yu X，Chen M，Jiang Z，et al. The two-component regulators GacS and GacA positively regulate a nonfluorescent siderophore through the Gac/Rsm signaling cascade in high-siderophore-yielding Pseudomonas sp. strain HYS.[J].Journal of Bacteriology，2014，196（18）：3259-70.
[2] Gao J，Yu X，Xie Z. Draft genome sequence of high-siderophore-yielding Pseudomonas sp. strain HYS.[J]. Journal of Bacteriology，2012，194（15）：4121.
[3] Yan Y，An C，Li L，et al. T-linker-specific ligation PCR（T-linker PCR）：an advanced PCR technique for chromosome walking or for isolation of tagged DNA ends[J]. 2003，31（12）：e68.
[4] Trinh Q，Xu W，Shi H，et al. An A-T linker adapter polymerase chain reaction method for chromosome walking without restriction site cloning bias.[J].Analytical Biochemistry，2012，425（1）：62-67.
[5] Trinh Q，Zhu P，Shi H，et al. A-T linker adapter polymerase chain reaction for determining flanking sequences by rescuing inverse PCR or thermal asymmetric interlaced PCR products.[J]. Analytical Biochemistry，2014，466（466）：24-26.。