培养基湿热灭菌原理

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培养基的灭菌

焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%
煤酚皂（来苏 1%-5% 尔）
2. 辐射灭菌
原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用：紫外线、X射线和γ射线。使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。
3．干热灭菌法
原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时。使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌
二. 培养基灭菌温度的选择
选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度。
三．影响灭菌效果的因素
微生物种类：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。传热与混合状况：影响受热均匀度。培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。
1．定义：
将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。
2．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。
温度随灭菌时间的变化
分批灭菌设备示意图
第一节灭菌的原理及方法

培养基的灭菌

一、常用培养基配置及灭菌

一、实验目的

1．了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；

2．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。

3．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理

培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。

1、热力灭菌：利用高温使菌体蛋白质变性或凝固，代谢发生障碍，导致细菌死亡。包括：

（1）焚烧法：用火焚烧，是很彻底的灭菌方法，适用于废弃的污染物品和有传染性的动物尸体等。

（2）烧灼法：直接再火焰上烧灼，用于接种环(针)和试管口或瓶口的灭菌。

（3）干烤法：在干烤箱通电后利用高热空气进行灭菌。一般加热160-170℃，维持2小时即可杀灭包括芽胞在内的一切微生物。主要用于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器等。

（4）煮沸法：煮沸100℃5分钟可杀死细菌的繁殖体，一般消毒以煮沸10分钟为宜。如需要杀死芽胞则要煮沸1-3小时。主要用于一般外科器械、注射器、胶管和食具等的消毒。

（5）间歇灭菌法：是利用反复多次的流通蒸汽，杀死细菌所有繁殖体和芽胞的一种灭菌法。本法适用于耐热物品，也适用于不耐热(<100℃)的一些物质如某些培养基的灭菌。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺氏流通蒸汽灭菌器内，100℃加热15-30分钟杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置37℃温箱中过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有繁殖体和芽胞全部杀死。若有某些物品不耐100℃，则可将温度降至75-80℃，每次加热的时间延长至30-60分钟，次数增至3次以上，也可达到灭菌目的，如用血清凝固器对血清培养基或卵黄培养基的灭菌。

高温灭菌的原理

高温灭菌是一种常见的杀灭微生物的方法，它利用高温对微生物的细胞结构和代谢活动产生破坏，以达到灭菌的目的。本文将详细介绍高温灭菌的基本原理及其相关的机制。

1. 微生物的耐热性

在探讨高温灭菌的原理之前，我们需要了解微生物的耐热性。不同类型的微生物对高温的耐受能力是不同的。有些细菌和真菌能够在相对高温下存活，而其他一些微生物，特别是病毒和孢子，对高温更具敏感性。因此，高温灭菌的效果受到杀灭目标微生物的特点和高温条件的影响。

2. 温度对微生物的影响

高温对微生物的影响是通过多个机制来实现的。其中，最主要的机制包括蛋白质、核酸和膜结构的破坏。

2.1 蛋白质的破坏

高温会引起蛋白质变性，即蛋白质的结构和功能发生不可逆的改变。蛋白质的变性受到温度和时间的影响。温度越高，蛋白质变性的速度越快。当蛋白质变性后，其二级和三级结构发生破坏，导致蛋白质失去原有的功能。此外，高温还可能导致蛋白质的氧化和热失活。

2.2 核酸的破坏

高温也能引起微生物细胞内的核酸变性。核酸分子包括脱氧核糖核酸（DNA）和核

糖核酸（RNA）。核酸的变性是指其双螺旋结构发生破坏，导致DNA链断裂，RNA

的次级结构和功能丧失。这些变性会阻碍细菌和其他微生物的遗传信息传递和代谢过程，最终导致细菌死亡。

2.3 膜结构的破坏

高温还会影响微生物细胞膜的结构和功能。细胞膜是微生物细胞的保护屏障，它控制物质的进出，并维持细胞内外环境的稳定。当高温作用于细胞膜时，膜脂质和膜蛋白的结构发生改变，破坏了膜的完整性。这导致细胞内外环境的失衡，细胞无法维持正常的代谢和生存，最终导致微生物死亡。

常用培养基制备灭菌与消毒方法

常用培养基制备灭菌和消毒方法
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
稀释混合平板法： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
常用培养基制备灭菌和消毒方法
微生物培养技术
1、斜面接种 2、液体培养基接种 3、穿刺接种将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培
常用培养基制备灭菌和消毒方法
常用培养基制备灭菌和消毒方法
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂 15～20g，水1000mL，PH7.0～7.2(后调)
常用培养基制备灭菌和消毒方法
高氏1号培养基
化学药品灭菌：
原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。
杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。
注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类
以及微生物所处的环境有关。
常用化学杀菌剂有：wk.baidu.com醇、醋酸、石碳酸
福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等
常用培养基制备灭菌和消毒方法
实验四微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种
或某一株微生物的过程。为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保

培养基的湿热灭菌

在发酵过程中，培养基灭菌主要有以下几个原因：如不灭菌，会使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降;杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降;杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常;有些杂菌会分解产物，使生产失败;如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。

灭菌方法分类

(一)化学物质灭菌

原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活。使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌。

常用的灭菌剂：甲醛 37% 戊二醛 2% 高锰酸钾 0.1%-0.25% 苯酚 0.1%-0.15%

漂白粉 5% 过氧乙酸 0.02%-0.2% 酒精 75% 焦碳酸二乙酯

0.01%-0.1% 煤酚皂(来苏尔) 1%—5%

(二)辐射灭菌

辐射灭菌的原理是利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用的有紫外线、X射线和γ射线。用于室内空气及器皿表面灭菌。

(三)干热灭菌

灭菌原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时。适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。

(四)湿热灭菌

灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。水煮常压灭菌：100℃。或饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟。适合培养基和发酵设备灭菌。

(五)过滤除菌

除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌。方法是使用0.01~0.45 mm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

培养基湿热灭菌

湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高。

一、方法

煮沸灭菌法；巴氏灭菌；间歇灭菌；高压蒸汽灭菌等。

（1）煮沸灭菌法：是指将待灭菌物置于沸水中灭菌的方法。煮沸时间通常为30-60分钟。该法灭菌效果较差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。

（2）巴氏灭菌：利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢。

（3）间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。

（4）高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。

二、对培养基的影响

1、形成沉淀物：有机物，如多肽类沉淀；无机物，如磷酸盐、碳酸盐等沉

淀。

2、破坏营养，提高色泽：褐变，产生氨基酸、焦糖或黑色素。

3、改变培养基的PH，一般为降低PH

4、降低培养基浓度，气温低时会增加冷凝水

三、解决方法

温度的选择

培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。

实验室常用消毒灭菌方法

实验室常用的器材一般包括玻璃器材、金属器械、橡胶制品及塑料制品等，每类器材的处理及消毒措施都有不同。严格的消毒灭菌工作极为重要，直接影响着整个实验能否顺利进行。

目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

1、湿热灭菌法

湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。

分为三种:

（1）流通蒸气灭菌法：是指在常压条件下，采用100摄氏度流通蒸气加热杀灭微生物的方法，灭菌时间通常为30-60分钟。该法适用于消毒以及不耐高热制剂的灭菌，但不能保证杀灭所有芽孢，是非可靠的灭菌方法。

（2）间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。

（3）高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。

2、干热灭菌法

是利用恒温干燥箱内120ºC～150ºC的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。

培养基的灭菌

• 连续加压灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大
规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一
般在135～140℃下处理5～15秒钟。
主要灭菌方法
高温对培养基成分的影响：
主要灭菌方法
消除高温有害影响的措施
采用特殊加热灭菌法；含易破坏成分的培养基应与其他成分分别灭菌后再合并，或者进行低压灭菌；对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先分别灭菌，再混合，避免产生磷酸盐沉淀。
相对热阻 1.0 3×106 2~10 1~5
主要灭菌方法
• 培养基成分对灭菌的影响
– 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。
• 培养基的物理状态对灭菌的影响 • 培养基中微生物数量对灭菌的影响 • 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响
– 培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。
响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法.
主要灭菌方法
低温维持法：在63℃下保持30分钟可进行牛奶消毒；
间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟Hale Waihona Puke Baidu以杀死所有营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低

培养基的灭菌

问题
说说芽孢或孢子的热阻要比营养细胞的热阻大的原因？
大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线
N/ N0 1
10-1 54
10-2
10-3
56
10-4
58
60
0
2
4
6
8
10
t (min)
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度
N/
下的死亡曲线
N0 1
10-1
105 10-2
10-3
10-4 0
116 121
5
108 110
消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的
1、化学试剂灭菌法
化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒
2、射线灭菌法 3、干热灭菌法 4、湿热灭菌法 5、过滤除菌法
电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱
常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿
培养基的灭菌
内容
1、灭菌的原理和方法 2、培养基的灭菌 3、湿热灭菌原理和影响灭菌的因素 4、间歇灭菌 5、连续灭菌
1、培养基如何分类？在发酵生产中常用的固体还是液体培养基？
2、说说培养基的六大营养要素？
根据营养物质的来源不同，培养基可分为：天然培养基、合成培养基和半合成培养基

培养基和发酵设备的湿热灭菌

• 优点：营养成分破坏少，生产效率高，热综合利用率高，大型企业自动化程度高。
培养基连消工艺流程图
2 4
6
7
5
1
3
图2-4 连续灭菌设备流程示意图 1-配料罐（拌料罐）2-蒸汽入口 3-连消塔 4-维持罐
5-培养基出口 6-喷淋冷却 7-冷却水
喷射加热冷却系统
蒸汽喷射加热器
生培养液
维ຫໍສະໝຸດ Baidu管
膨胀阀急聚蒸发室
真空
灭菌好的培养液
图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程
板式换热灭菌系统
灭菌好的培养液
蒸汽
水冷却段
热回收段
加热段
冷却水
生培养液
维持段
图2-6 薄板换热器连续灭菌流程
• 优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。
二、培养基的工业灭菌方法
培养基的湿热灭菌方法： 1.连消 • 定义：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然
后进入到反应器的杀菌方法就是连消，又称连续灭菌。灭菌条件126-132℃，20-30s，在维持罐中保温8-20分钟。 • 所需设备：连消塔、维持罐及冷却器
反应器升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气？当温度升到灭菌温度（ 121℃ ）时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌，防止罐内气压过高。 3、发酵培养基的体积

水浴湿热灭菌的原理

水浴湿热灭菌是一种常用的微生物灭活方法，通过将试验仪器、培养基、药品等放入预热的水中加热，将其中的微生物迅速灭活。其原理主要包括温度及湿度的作用、蛋白质变性和微生物细胞结构破坏等几个方面。

首先，水浴湿热灭菌的关键是将微生物处于高温高湿的环境中，这样可以有效地杀灭细菌、真菌、病毒等微生物。高温会破坏细胞的膜结构和功能，使微生物无法正常生长和繁殖。高湿度则可以提高灭菌效果，因为细菌在干燥环境中会形成耐热孢子，从而增加灭菌的难度。

其次，温度对微生物生长和存活具有重要影响。一般情况下，高温会导致微生物蛋白质变性、酶活性丧失等，从而破坏其细胞代谢和生理功能。当温度达到一定程度时，细菌、真菌和病毒的蛋白质结构开始破坏，使其无法正常进行新陈代谢，最终导致死亡。

蛋白质变性是水浴湿热灭菌中十分重要的灭菌机制。当蛋白质受到高温的作用时，部分非共价键被破坏，使蛋白质三维结构发生变化，从而失去自身功能。这种变性现象对于微生物细胞来说至关重要，因为它会导致蛋白质酶、酶和其他结构蛋白的失活，进而影响微生物的代谢和生长。

此外，高温会对微生物细胞的其他结构组分产生影响。例如，微生物细胞壁中的多糖、脂质等物质也会在高温下发生变性，使细胞壁完整性受损。这样，外

部环境中的有害物质能更容易地渗透进入微生物细胞内部，进一步破坏细胞结构和功能。此外，高温还会使微生物DNA发生损伤，从而影响微生物的遗传信息传递，阻碍其正常的生长和繁殖。

总的来说，水浴湿热灭菌通过高温和高湿度的作用，引起微生物细胞蛋白质变性、细胞结构破坏等一系列变化，从而杀灭细菌、真菌、病毒等微生物。尽管水浴湿热灭菌是一种简单、经济且常用的灭菌方法，但其效果仍受到多种因素的影响，包括温度、湿度、时间和操作方法等。因此，在进行水浴湿热灭菌时，需要根据具体的需求和实验条件，选择适当的温度和时间，以确保灭菌效果的可靠性。

培养基的配制及灭菌

一．实验目的

1.三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。

2.三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装

与灭菌。

3.高温蒸汽灭菌原理的学习。

4.LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。

二．实验原理

1.高温灭菌的原理：

由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。

高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意：①使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。

2.培养基的配置原理：

微生物的生长依赖于可利用的营养物质和适宜的生长环境。培养基是用于培养，转移，贮存微生物的固体，半固体或液体的营养物质。培养基中含有微生物所需的全部营养物质，包括碳源、氮源、能源、无机盐、水分和生长因子。适宜的pH对微生物的生长是必不可少的。

培养基的物理状态有三种：液体、半固体和固体。这些培养基的主要区别是在固体和半固体培养基里面加了固化剂------琼脂。当将琼脂加入溶液中时，在98℃能融化成有一定粘性的液体。并在42℃凝固。琼脂具有的特性有：不易被微生物降解；接近无色等。对于固体培养基需要加入琼脂量约为 1.4%~1.6%，半固体培养基加入约0.6%~0.8%。

4-培养基的灭菌详解

第三节培养基的灭菌设备
发酵工业需纯种培养，若在培养过程中污染杂菌，则会导致： ①基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降； ②产物的提取或分离困难，造成收率降低或使产品的质量下降； ③改变反应介质的pH，使生物反应发生变化； ④分解产物，使生产过程失败； ⑤发生噬菌体污染，使生产过程失败。

为了保证培养过程的正常进行，防止染菌的发生，对大部分微生物的培养，包括实验室操作和工业生产，均需严格的灭菌。
液体培养基的灭菌的方法有： ⑴利用热能； ⑵利用化学药物； ⑶利用机械方法，例如过滤、离心分离、静电等方法； ⑷采用x—射线、β—射线、紫外线、超声波、微波、电磁波等对物料进行灭菌。
（二）培养基分批Βιβλιοθήκη Baidu菌
间歇灭菌的操作（如图）：发酵罐的空气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料完毕，开搅拌以防料液沉淀。开夹套蒸气阀，使料液预热升温至80℃，关闭夹套蒸气阀门。开空气、出料、取样阀门，进蒸气，开排汽阀，包括小辫子（进料管、补料管、接种管和排汽管）。当升温至 110℃左右，控制进出汽阀门直至温度121 ℃，保温 30min。保温结束后，关过滤器排气阀、排汽阀、进汽阀；关夹套下水道阀；开冷却水进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开空气进气阀通入无菌空气，通入冷却水，将培养基温度降至培养温度。

培养基灭菌的常用方法

培养基灭菌是在微生物实验室中进行微生物研究和培养时必不可少的

步骤之一、灭菌的目的是杀死或去除培养基中的所有微生物，以确保实验

得出的结果是由引入的特定微生物引起的，而不是其他微生物的污染。下

面将介绍一些常用的培养基灭菌方法。

1.热灭菌方法（高温灭菌）：

热灭菌是一种简单而广泛使用的培养基灭菌方法。高温能有效地杀死

或去除培养基中的大部分微生物。常见的热灭菌方法包括：

-干热灭菌：将培养基放入烤箱或高温灭菌器中，在170°C至

180°C下加热2至3小时。这种方法适用于含有熔点较高的成分的培养基，如糖肉汤。

-湿热灭菌（压力灭菌）：常用的方法是使用高压蒸汽灭菌器（也称

为压力釜）进行培养基的灭菌。在121°C至134°C的高温下，通过给培

养基施加高压蒸汽，可以在短时间内杀死或去除培养基中的微生物。这种

方法适用于绝大多数常见的培养基。

2.过滤灭菌方法：

过滤灭菌是一种无需高温的灭菌方法，适用于含有热敏感成分的培养基。过滤灭菌方法通常使用微孔过滤器将培养基通过过滤膜来除去微生物。常见的过滤灭菌方法包括：

-常压过滤：将培养基通过微孔滤膜过滤，常用的滤器孔径为0.22微

米或0.45微米，以保留大部分微生物。这种方法适用于灭菌前培养基体

积较小的情况。

-打压力过滤灭菌：通过使用活性碳或膜微孔过滤器，将压力加到过

滤器上，可以加速微生物的过滤速度。这种方法适用于较大体积的培养基。

3.化学灭菌方法：

化学灭菌是使用化学物质来杀灭或去除培养基中的微生物的方法。常

见的化学灭菌方法包括：

-醋酸灭菌：将培养基浸入醋酸中浸泡3至4小时，然后用蒸馏水冲洗，可以有效地杀死或去除绝大多数微生物。这种方法适用于含有热敏感

植物组织培养常用的灭菌方法

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

1、培养基用湿热灭菌

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1mpa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05mpa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

关阀再通电后，压力表上升达到0.1mpa时，开始计时，维持压力0.1-0.15mpa，20分钟。

按容器大小不同，保压时间有所不同。见表1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。

表1. 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间

容器的体积/ml 在121℃灭菌所需最少时间/min

20-50 15

75-150 20

250-500 25

1000 30

到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5mpa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。

微生物灭菌原理与方法

灭菌

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。

无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。

植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。