抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响

抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响

冯景（201111201028）张书（201111201036）

指导老师：张伟

摘要：为了探究抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响，使用了MTT比色法测定了细胞给不同浓度后的相对数量，研究其对细胞增殖的影响；使用荧光染色法研究其对细胞形态的影响，并观察细胞凋亡形态。关键字：阿霉素细胞凋亡 MTT

Abstract：To explore the anticancer drug doxorubicin effect on cell proliferation and apoptosis, studying its effects on cell proliferation by the MTT that analyzes the relative number of cells after different concentrations; learning its affect on cells morphology using fluorescence staining and apoptotic morphology was observed. Keywords: Apoptosis doxorubicin MTT

近50年的抗肿瘤药物研究开发工作使肿瘤化疗取得相当的进步，特别是使血液系统恶性肿瘤患者生存时间明显延长，但严重威胁人类生命健康的占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗尚未达到满意的疗效。抗肿瘤药物正从传统的非选择性单一的细胞毒性药物向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。

目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用，部分常用的抗肿瘤药物及其作用机制如表1所示，其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。

材料和方法

1实验材料

1.1生物材料人胃癌细胞BGC-823

1.2试剂MTT母液(5mg/mL)、裂解液（10%SDS—0.01N HCl）、胰酶、PBS溶液、PI 、Ho.33342、

阿霉素。

阿霉素：是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀

灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第

二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。

PI（碘化丙啶）：是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能

穿过破损的细胞膜而对核染色。

Ho.33342 ：结合于DNA的AT碱基对，释放蓝色荧光,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察

2实验方法步骤

2.1取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为: 3-4×104/mL，取细胞接种到96

孔板，每孔200μL，即8000细胞/孔。

2.2加药处理:待细胞贴壁后于第二天中午换液加药(可在24小时进行), 换200μL新鲜培养基，用

无菌水配制相应浓度的药液（详细配置药液方法见表2），每个孔加入4μL配制后药液，作用

72小时。

表2.阿霉素浓度配制表

1 2 4 6 8 10

阿霉素ul 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2 4

无菌水ul 39.6 39.2 38.4 37.6 36.8 36

总体积ul 40 40 40 40 40 40

图1.96孔板加样示意图

2.3测定: 取测定孔, 弃去培养基,加100μL 新鲜的培养基, 加12 μL MTT，8小时后加

100μL裂解液。过夜后，用酶标仪测定OD值。

2.4将酶标仪测出的数据用SPSS软件进行分析，找出半数抑制浓度( IC50 )，IC50是指在用

药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中, 就是以对照组吸光度OD 值减

少一半所需的药物浓度为IC50。

2.5取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代。取1瓶细胞传到4瓶。

2.6第二天加入药物或水。本组实验加入4μg/ml的药物培养基。

2.748小时后，收集培养液，用胰酶适度消化细胞，用收集的培养液吹打细胞，将分散成单

个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm, 离心15 min去上清，用0.2毫升PBS重悬细

胞。

2.8取178 μl PBS细胞悬液，加入PI 20 μL（终浓度100 μg/ml），Ho.33342 2 μL（终浓度

10μg/ml），混匀，37度温箱中避光标记15min。(带手套操作）

2.91000rpm，离心10min，弃上清，加30μL PBS重悬，取10 μL滴于载玻片上，盖片（不

能有气泡或漂起），保存于暗处。

2.10荧光显微镜观察拍照（紫外激发）。

实验结果

1MTT实验结果

表3 各药物浓度梯度对应的OD值

序号0 1 2 4 6 8 10

1 1.678 1.207 1.265 0.414 0.388 -0.148 -0.263

2 1.602 1.509 1.15

3 0.32

4 0.301 -0.146 -0.3

3 1.586 1.531 1.197 0.366 0.09

4 -0.107 -0.228

4 1.653 1.539 1.2

5 0.419 0.6

6 -0.142 -0.275

均值 1.62975 1.4465 1.21625 0.38075 0.36075 -0.13575 -0.2665

抑制率0.11244 0.25372 0.76638 0.77865 1 1