反相色谱法测定有机化合物(精)

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反相高效液相色谱紫外检测法测定季戊四醇_李健秀

第32卷2004年8月分析化学(FENX I HU AX U E) 研究报告

Chinese Journal of A naly tical Chemistry 第8期

1122

反相高效液相色谱紫外检测法测定季戊四醇

李健秀* 景丽洁

(吉林化工学院化学工程系,吉林132022)

孙红

(中国石油天然气总公司吉林石化分公司乙烯厂,吉林132022)

2003-03-08收稿;2004-01-15接受1 引言

季戊四醇是一种工业用途比较广泛的有机化工产品,主要用于涂料工业。在生产季戊四醇的过程中,往往伴随着二季戊四醇副产物的生成,即使在季戊四醇最终产品中,也含有一定量的二季戊四醇。目前尚缺乏完善的方法对二者进行同时测定。中华人民共和国国家标准推荐工业用季戊四醇含量的测定方法为重量法(GB/T 7815-1995),虽然此法准确度高,但比较繁琐费时,并且只适合于单季戊四醇含量的测定。国内外文献报道的季戊四醇和二季戊四醇的分析方法主要有气相色谱法和高效液相色谱法。前者需要对样品进行衍生化处理,后者则普遍认为紫外检测器无法检测,而采用示差折光检测器检测。本研究采用高效液相色谱紫外分光光度检测器,短波长下进行检测,同时测定季戊四醇产品中的季戊四醇和二季戊四醇含量。目前这种方法国内外未见报道。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂 L C -10AD 高效液相色谱仪,配有SP D -10A V 紫外-可见分光光度检测器和C -R7A 数据处理机(日本岛津公司)。季戊四醇(98%)、二季戊四醇(90%)均购自美国A CRO S 公司;乙腈(一级色谱纯)购自天津四友生物医学技术有限公司。

反相高效液相色谱法

2.高压定量进样阀（常用）
泵
泵
柱
柱
排放进样
排放进样
百度文库
图六通进样阀
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
发展趋势：填料粒度小柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入色谱柱，洗净备用
检测系统
用反相高效液相色谱法分离芳烃
预备知识
与气相色谱法的比较：流动相：由气相液相
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而 HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
与经典的液相色谱法的比较：
在经典的液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化，这种色谱技术称作高效液相色谱法。
恒压泵：输出压力恒定，但流速随系统阻力变化恒流泵：流速恒定，压力随阻力变化
要求：流量稳定
精度在1～2%之间
压力平稳无脉动
往复泵压力有波动，所以柱前设缓冲装置（压力脉动阻力器）
流速可调
一般分析仪器：1～2mL/min 制备仪器：10～20mL/min
进样系统
1.注射器进样（隔膜进样）带压进样停流进样

正相色谱和反相色谱

正相色谱（Normal Phase Chromatography）

正相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于极性差异的液相色谱法。所谓正相色谱，是因为在正相色谱柱中，填充物通常是一些极性

较高的固体相，例如硅胶（silica gel）和氧化铝（alumina）等。正相色谱柱可以分离无电荷的极性化合物，例如一些羟基化合物和醇类分子。在正相色谱中，毒理学家可以分离和鉴定一些有机物。

反相色谱（Reverse Phase Chromatography）

反相色谱是一种将物质分离的方法，是一种基于亲疏水性质差异的液

相色谱法。所谓反相色谱，是因为在反相色谱柱中，填充物通常是由

一个疏水的固体相组成，例如碳颗粒、聚合物等。反相色谱柱可以分

离各种极性分子，例如对有机药物、蛋白质、核酸等进行分离和纯化。毒理学家可以使用反相色谱技术进行药物开发和毒性评估。

正相色谱和反相色谱之间的不同

在正相色谱中，爱保者可以利用样品和固相之间的极性差异来分离和

纯化物质。正相色谱通常用于分离和纯化极性药物和天然产物，如氨

基酸，多肽和糖。在反相色谱中，爱保者利用样品和固相之间的非极

性差异来分离和纯化化合物。反相色谱通常用于分离和纯化疏水药物

和天然产物，如脂肪酸，核酸和激素。

正相色谱和反相色谱在毒理学中的应用

正相色谱和反相色谱都广泛应用于毒理学，尤其是药物开发和毒性评估。毒理学家可以利用这些技术来分离和纯化化合物。毒理学家应用

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）联

有机分析气相色谱分析法

气相色谱（Gas Chromatography，GC）是一种常用的分析技术，常用于定性和定量分析有机物的混合物。它是基于样品中各组分在固定相和气相之间的分配行为，通过分离和检测来实现。

GC的基本原理是：通过将样品溶解在插入气相载气的载气流中，然后通过柱上的固定相（通常是涂布在柱壁上的液体或固体）进行分离。样品中的各成分根据其相对亲和力与固定相之间的分配均匀度不同，在柱中以不同的速率移动。最后，通过检测器检测到每个组分并将其呈现为峰。

GC的分析过程包括以下几个步骤：

1.采样：样品可以通过直接进样或通过气相吸附在固定相上进行前处理来引入GC系统。

2.进样：将预处理过的样品进样到气相色谱仪的进样口中。

3.柱分离：样品进入柱中，在固定相上进行分离。柱的选择取决于要分离的化合物的性质。

4.检测：通过检测器检测到每个组分，生成峰，并根据峰的大小和时间来量化和鉴定各组分。

5.数据处理：根据峰的的尺寸、峰的时间和峰的面积等参数，进行数据处理和分析。

GC有机分析的应用广泛，可用于定性和定量分析不同样品中的有机化合物。它常用于环境、食品、药品、石油和化学品等领域。

在环境领域，GC常用于检测空气中的挥发性有机化合物（VOCs），例如有毒气体、有机溶剂和挥发性有机化合物。通过GC的分离和检测能力，可以定量分析各种有机化合物的浓度，帮助评估环境污染情况。

在食品领域，GC可用于分析食品中的残留农药、塑化剂、重金属和食品添加剂等有机物。通过GC的分离和检测能力，可以实现对食品中不同有机物的定量分析和鉴定。

液相色谱简介（反相）

高效液相色谱法（反相液相色谱）

一、液相色谱法方法的分类和选择

1、方法的分类：

根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。

正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。

反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。

在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。

正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。

2、方法的选择：

HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。

反相色谱法ReversedphaseHPLC

高效液相色谱一般在室温下进行分离和分析，适于分离分析生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物和各种高分子化合物如：蛋白质、氨基酸、核酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料、药物等。
④HPLC除用于分离和分析外，还可用于制备
注意：由于气相色谱更快、更灵敏、更方便而且耗费低，因此凡是能用气相色谱法分析的样品一般不用液相色谱法。
(4)Reversed-phase HPLC most common (high polarity solvent, high polarity solutes elute first) R is C8 or C18 hydrocarbon
(4) Stationary Phase Choice Choose column with similar polarity to analyte for maximum interaction Reversed-phase column (nonpolar) R hydrocarbon
正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正相色谱法适于分析极性化合物。氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖类物质。

中国药典反相色谱

《中国药典》是中华人民共和国国家药品标准，用于规范药品的生产、检验和质量控制。在药典中，反相色谱（Reverse Phase Chromatography，RPC）是一种常用的分离

和分析技术。反相色谱法是一种基于样品在固定相和流动相之间分配系数的差异来实现分离的方法。在药典中，反相色谱法主要用于药物及其相关化合物的含量测定、杂质鉴定和纯度分析等。

反相色谱的主要特点如下：

1. 固定相：反相色谱中使用的固定相为非极性或弱极性材料，如化学键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶等。这些固定相有利于非极性或弱极性化合物的分离。

2. 流动相：与固定相相比，流动相通常为极性或弱极性溶剂，如水、甲醇等。流动相的选择会影响色谱柱的分离效果和分析时间。

3. 色谱条件：反相色谱法中的色谱条件包括色谱柱、流动相组成、流速、检测器等。这些条件需要根据待分析样品的性质进行优化，以实现良好的分离效果。

4. 应用：反相色谱法在药典中的应用主要包括药物含量测定、杂质鉴定、纯度分析等。对于不同类型的化合物，需要选择合适的固定相、流动相和色谱条件，以实现有效的分离和分析。

总之，《中国药典》中的反相色谱法是一种重要的分离和分析技术，用于药物及其相关化合物的检验和质量控制。在实际应用中，需要根据样品的性质和检测要求，选择合适的固定相、流动相和色谱条件，以实现有效的分离和分析。

反相离子对色谱法

反相离子对色谱法（Reversed-Phase Ion Pair Chromatography, RP-IPC）是一种液相色谱法，常用于对带正电或负电的离子类化合物进行分离和定量分析。

该方法的原理是在一定的流动相条件下，使用一种含正离子对剂的有机溶剂作为移动相，使得样品中的离子类化合物与正离子对剂形成离子对的结合，在反相色谱柱上进行分离。正离子对剂通常是醇胺类、季铵盐类或草酸钠等。其中带正电的离子类化合物与正离子对剂形成胶束结构，经过反相液相色谱柱后分离，负电的离子类化合物与正离子对剂发生离子对结合，再经柱分离。

与传统的反相色谱相比，反相离子对色谱法的优势在于可以分离和定量测定带电离子类化合物，如药物类、生物活性物质、蛋白质和核酸等。同时，由于离子对剂的存在，可以提高某些带电离子类化合物的保留率和分离度，增强色谱法的选择性和灵敏度。

反相离子对色谱法在药物分析、环境分析、食品安全等领域有广泛的应用。它可以用于测定药物中杂质的含量、药物代谢产物的分离和定量、食品中添加剂的检测等。同时，该方法还可以与其他色谱技术（如气相色谱、离子色谱等）或质谱联用，进一步提高分析的选择性和灵敏度。

(完整版)反向液相色谱的工作原理

谁能告诉我一下反向液相色谱的工作原理吗？它与正向的有什么区别吗？

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18 、C8 、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及

氨基酸类等）。

化学实验知识：比色法测定有机化合物含量的实验方法

化学实验知识：“比色法测定有机化合物含

量的实验方法”

比色法测定有机化合物含量的实验方法

化学实验是化学学习的重要环节，其中比色法测定有机化合物含量是常用的实验方法之一。该实验方法主要利用有机化合物和某些化学试剂反应后形成的色素来测定有机化合物的含量。下面将详细介绍比色法测定有机化合物含量的实验方法。

实验步骤：

1.准备样品

将待测有机化合物称取一定量，溶于特定溶剂中，制备成标准溶液。一般选择丙酮或乙醇作为溶剂，浓度一般为10mg/mL。

2.加试剂

将制备好的标准溶液取一部分置于试管中，然后加入一定量的氨水和硫酸氧化剂，静置反应。

3.比色

待反应结束后，用紫外分光光度计或比色皿，将反应液的吸光度读出，然后进行比色计算。

计算方法：

（1）求得片内标准曲线

取一定浓度的邻氨基苯酚溶液，逐渐加入氨水和硫酸氧化剂，同样进行反应和比色，从而得到吸光度和浓度的关系，以此绘制出片内标准曲线。

（2）计算未知浓度

根据反应液的吸光度和片内标准曲线，求得待测有机化合物溶液的浓度。

优点：

1.操作简单。

2.灵敏度高，可以检测不同浓度范围的物质。

3.测量时间短。

4.实验步骤简单，易于操作。

不足：

1.受干扰因素多，如溶液的色度等影响结果，因此需要注意实验操作。

2.仅适用于有机化合物含量测定。

总之，比色法测定有机化合物含量的实验方法简单易行，且具有灵敏度高、操作方便、测量时间短等优点。通过实验教学，不仅可以提高学生的实验技能和实验思路，还可以加深学生对化学原理的理解和应用。

反相高效液相色谱法测定九种有机酸

以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。

应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的p H 值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性[1]。例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1% 的甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。对于弱碱性样品，向流动相中加入1 % 的三乙胺，也可达到相同的效果[2~6]。虽然RPC 方法建立时最好选用pH 微小改变不影响分离的流动相，但pH 值的较大变化往往会对分析结果产生很大影响，因此流动相pH 值的调节是分析过程中至关重要的一个环节，本文以反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例考察了不同流动相p H 值对分析结果的影响，指出准确调节流动相p H 值的关键所在，有助于提高分析结果的准确性。

摘要以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。

igg反相色谱法600字左右

反相色谱法（Reversed Phase Chromatography，简称RP-HPLC），是高效液相色谱法（HPLC）中最常用的一种分离方法之一。它基于样品中化合物与固定相之间亲疏性相互作用的不同，通过调整流动相的

极性来实现化合物的分离和定量分析。反相色谱法在药物分析、环境

监测、食品安全和生物科学等领域得到了广泛应用。

1. 分析原理

反相色谱法的分析原理是利用液相固定相与待测物之间的亲疏性相互

作用进行分离。通常情况下，固定相是非极性的疏水基质，而流动相

是极性溶剂。在反相色谱柱中，待测物会根据其与固定相亲疏性的不同，以不同的速率通过柱子，从而实现分离。即使化合物在流动相中

溶解性相近，也可以通过调整流动相的成分和性质来实现分离。

2. 操作步骤

进行反相色谱法分析时，一般需要以下操作步骤：

- 准备样品和流动相。样品需要经过适当的预处理和稀释，以保证样品中待测成分的稳定性和溶解度。流动相的成分和性质也需要根据待测

物的特性进行合理选择。

- 设置色谱条件。包括选择合适的反相色谱柱、调整流动相的流速和温度等参数。这些条件会影响分离的效果和样品的保留时间。

- 进行样品分析。将样品以适量的流动相作为载气，通过色谱柱进行分离。根据各种化合物之间的亲疏性差异，实现样品中各成分的分离和

定量分析。

- 数据处理和结果解释。对色谱图谱进行峰分析和定量计算，得出待测物的含量和纯度等相关数据。

3. 应用领域

反相色谱法具有分离效率高、灵敏度高、分析速度快等优点，因此在各个领域得到了广泛的应用。在药物分析中，可以用于药物成分的检测和定量分析；在环境监测中，可以用于检测水体和大气中的有机污染物；在食品安全领域，可以用于检测食品中的添加剂和残留农药等有害物质；在生物科学研究中，可以用于分析细胞成分和药物代谢产物等。

反相高效液相色谱法

对组分的物理或物理化学特性有响应
通用型
对试样和洗脱液总的物理或物理化学特性有响应
本实验采用紫外光度检测器
实验步骤
1、用甲醇配成浓度分别为 30ug/mL和10 ug/mL 的混合标准溶液。 2、按下述色谱条件设定色谱仪：柱温：室温；流动相流速：A泵：甲醇，0.9 mL/min B泵：蒸馏水，0.1 mL/min 泵最大压力：15 MPa 检测波长：254 nm 时间：6 min 3、根据仪器操作条件，待基线稳定后，分别进标准样品和未知样品各10uL，获得标准样品和未知样品的谱图。 4、以标准样品谱图为基准，作单点标准曲线，然后求出未知溶液中苯和萘的浓度。
组分在固定相中物质的浓度 Cs K= = 组分在流动相中物质的浓度 Cm
流动相为非极性而固定相为极性物质的色谱称正相液相色谱法，以流动相为极性而固定相为非极性的色谱称反相液相色谱法。将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离烷基苯类化合物。本实验：固定相：ODS-C18，流动相：甲醇－水混合溶液分离组分：苯和甲苯的混合溶液
发展趋势：填料粒度小柱径小装柱技术：干法：填料粒度大于20µm时可用。湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入色谱柱，洗净备用

反相高效液相色谱

液液分配色谱法中的化学键合固定相：目前广泛使用的化学键合固定相
是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色
谱方法(简称键合相色谱法)可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色
谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。按照固定
相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法
发展历史：
• 1906年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法” （Chromotography）和“ 色谱图”（Chromatogram）的概念。
• 1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。
• 1952年，英国学者Martin和Synge提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法。
2、液-液分配色谱法(liquid-liquidchromatography) ：液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数(K)的不同而被分离
3、离子交换色谱法(ionexchangechromatography)：以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲
6、手性色谱法(chiralchromatography)：对映体在普通条件下的理化性质是相同的，因此分离对映体需要在手性条件下进行。分离对映体的色谱方法称为手性色谱法。手性色谱法分为间接法和直接法两种。间接法是将对映体与一定的手性衍生化试剂反应，使其由对映体转变为非对映体，再利用他们理化性质的差异，用一般的色谱条件进行分离。直接法不需作衍生化反应，直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离，应用较多

反相色谱原理

反相色谱是一种常用的色谱分离技术，其原理基于样品成分与固定相之间的互相作用差异。

在反相色谱中，固定相通常是非极性物质，如碳链化合物。流动相则是极性溶剂，如水与有机溶剂的混合物。样品溶液通过柱子时会与固定相上的表面发生相互作用。对于非极性分子而言，它们更喜欢与固定相发生相互作用而停留在柱子上，从而滞留时间较长；而极性分子则与固定相的相互作用较弱，因此滞留时间较短。

通过调节流动相的组成，可以控制固定相与样品成分之间的相互作用。当流动相中有更多的有机溶剂时，样品成分与固定相之间的作用会减弱，从而使样品成分的滞留时间缩短。反之，当流动相中的水含量较多时，样品成分与固定相之间的相互作用增强，样品成分的滞留时间变长。

通过在不同的滞留时间点采集样品，可以得到不同的成分分离结果。这些成分可以通过检测器进行检测和分析。常见的检测器包括紫外-可见吸收光谱检测器和质谱检测器等。

总的来说，反相色谱的原理是利用固定相与样品成分之间的相互作用差异实现样品分离和检测。调节流动相的组成可以控制样品成分的滞留时间，从而实现对样品的分析和检测。