如何运用实时荧光定量PCR技术进行动物源性成分检测

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荧光定量PCR法检测饲料中的牛、羊成分

列，别设计相的引物与探针。牛的探针和引物分即
１１２引物及探针设计（Ｅ公叫的ＰｉｒｘｒｓＴ．．ＰｒｍｅｐｅｓＭＥ
１．件）５软
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下游引物： ’ ＴＡＴＴＧＴ５ＴＧＧＡＧＣＡＴＴＧＧＧＣ３ ’ 牛的探针：ＦＡＭ一 ’ ＴＴＣ５ＴＴＣＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣ
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羊的探针：ＶＣ一 ’ Ｉ５ＡＧＧＧＡＴＣＣ ’ ＣＣＴＴＴＣ３一
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佩翻研究
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维普资讯
检测技术
１．酱通Ｐ．１２ＣＲ法（合酶链式反应）聚
一
般ＰＲ反应条件Ｃ
ｌＢｕｆｅ０Ｘｌｒｆ
疯牛病全称 “ 海绵状脑病 ” 是一发在牛牛。种身上的进行性中枢神经系统病变，｝前研究表明，＿Ｉ该病是由一种称为脑病毒的蛋白质所引发，其症状ｊ羊瘙痒症类似。人方面也柯类似症状的疾病，为在称 “ 雅氏症 ” 克。医学发现人 “ 雅氏症 ”叮能与携带病克毒的动物性食品有关，已经引起了国内外食品安全
快速、有效的检测方法防Ｉ疫 Ⅸ 牛、羊肉骨粉的使ｌ：
用。
不同物种都具有遗传卜独特性，的陔独特性体现在携带遗传信息的ＤＮＡ分ｌ。换言之，牛与千之：所以被认为足不同的、特的物种，独其最根本的原肉是牛与羊都具有自身特性的ＤＮＡ序列。所谓特异性序列是指某物种的某些ＤＮＡ序列为自然界其他物种所没有的。闪此根据卜述物种彳毖组水平Ｌ的Ｅ不同，我们ＮＣＢ上检索得到牛与羊的特异性序Ｉ

基于实时荧光PCR方法的牦牛肉源性成分鉴别

基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4426-443丨页研究报告Research Report基于实时荧光P C R方法的牦牛肉源性成分鉴别郭华麟1明玥1李轲2时淄航1尤祯丹u蒋玉涵陈传君徐超2韩国全y1四川农业大学食品学院，雅安,625014; 2郑州海关检验检疫技术中心，郑州,450003; 3四川农业大学食品加工与安全研究所，雅安，625014* 通信作者，*********************.cn摘要为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法,本研宄基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物的C y A基因序列差异，设计其特异性引物。

特异性实验结果表明，猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发生交叉反应；灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/jxL;抗干扰实验结果表明，当牦牛肉的添加量为1%时仍可检出；对市场上的20份不同种肉样进行检测，除牦牛肉样品检测结果呈现阳性外，其余肉样均为阴性。

本实验所建立的实时荧光PCR方法为牦牛源性成分鉴别提供一种快速、准确、专属性强的检测方法。

关键词实时荧光PCR,牦牛肉，鉴别Identification of Yak Beef Origin Components Based on Real-time PCRGuo Hualin 1Ming Yue 1Li Ke2Shi Zihang1You Zhendan 1,3Jiang Yuhan u Chen Chuanjun u Xu Chao2Han Guoquan1Food Science College of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014; 2 Zhengzhou Customs of the People's Republic of China, Zhengzhou, 450003; 3 Institute of Food Processing and Safety of Sichuan Agricultural University, Ya'an, 625014*Correspondingauthor,*********************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.004426Abstract In order to establish a real-time PCR method for detection of yak beef origin,the specific primers are designed based on comparing the sequence differences of Cytb gene between yak cattle,chickens,pigs,sheep,and duck.Specificity test shows that the DNA of pork,chicken and yellow beef do not have a cross react with the primers;sensitivity test shows that the minimum detection limit of the method is 0.004 ng/jxL;anti-interference experiment shows that it can still be detected when the addition of yak is 1%. 20 different meat samples on the market are tested.Except yak meat samples show positive results,other meat samples are negative.The real-time PCR method established in this experiment provides a rapid,accurate and specific detection method for identification of y ak derived components.Keywords Real-time PCR,Yak,Identification牦牛肉的蛋白质含量丰富，营养成分优于其他种类的牛肉，作为一种优质肉类而广受消费者喜爱 (邱翔等，2010; Doosti et al.，2014; Iwobi et al.,2015)。

实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分

人的重大民生问题。肉制品中掺杂掺假是我国食品行业中存在的问题之～，一些不法商贩或企业为获取高额利润，铤而走险以廉价的鸭肉冒充羊肉、牛肉进行生产经营，欺骗消费者。由于鸭肉的纹理相对于猪肉比较像牛羊肉，且在加工过程中往往会加入
型恒温混匀仪、掌上离心机、台式高速离心机（Ｃｅｎ —
ＰＣＲ在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了传统ＰｃＲ产物的污染和ＥＢ（溴化乙锭）带来的危害，自动化程度高，检测周期短，且扩增目的片段较小，尤其适用于经过深加工的食品，在动物源性成分鉴别检测中的具有
１．１材料
物源性成分的普通ＰＣＲ／实时荧光定量ＰＣＲ鉴定方
法和标准，但还未制定实时荧光定量ＰＣＲ检测鸭源
性成分的标准。与普通ＰＣＲ相比，实时荧光定量
１．１．１主要仪器设备高通量自动化样品处理工作站（ＦＡＳＴＨ２１），瑞士ＣＯＮＳＵＬＡＲ公司产品；小
羊肉粉、香精等添加剂以掩盖其造假行为，使掺假产
品具有更大的欺骗性和隐蔽性，这种肉类掺杂掺假
行为违反我国《食品安全法》的有关要求，严重危害

羊乳中动物源性成分的实时荧光PCR检测

分析与检测羊乳制品的营养价值高，现代营养学的相关研究表明，羊乳含有200多种营养物质和生物活性因子，其蛋白质、矿物质和维生素的总含量均高于牛乳[1]。

羊乳中蛋白质凝块细而软，脂肪颗粒较小，易消化吸收[2]，人体对羊乳的吸收率在94%以上，特别适合婴幼儿、老年人和身体虚弱者饮用。

营养成分组成及基础结构、各营养元素配比以及营养特性都与母乳最为接近，因此在婴幼儿食品中优势明显。

同时羊乳中不含过敏性蛋白，不易出现过敏等现象，被营养学家推荐为牛乳过敏人群的最佳替代乳品[3-4]。

近年来，羊乳相关产品的流行已渐成趋势，市场上产品种类越来越多，在经济利益的驱动下，一些不法商贩和企业在羊乳中掺入牛乳以降低成本，牟取暴利。

实时荧光PCR技术从基因水平分析物种来源，Taqman real-time PCR法具有灵敏度更高、特异性更强的特点。

1　材料与方法1.1　材料与仪器1.1.1　样品鲜羊乳来自内蒙古蒙恩公司纯羊奶，牛乳来自市售伊利集团有限公司。

1.1.2　主要仪器和材料仪器：实时荧光PCR仪（Quant StudioTM 7 Flex）购于赛默飞世尔公司，超微量紫外分光光度计（Nano drop one）购于赛默飞世尔公司。

试剂：PCR引物和探针(上海生工生物工程有限公司合成)；Wizard 磁珠法食品DNA纯化系统（货号：FF 3751）由美国Promega生物技术公司生产；Probe qPCR mix（货号：RR391A）TakaRa（中国）宝日生物公司；Real-time PCR Bovine DNA Detection Kit（货号：RR910）TakaRa （中国）宝日生物公司。

1.2　实验方法1.2.1　脱脂样品的制备新鲜奶粉中脂肪含量较高，需要先去除脂肪纯化样品[6]。

样品冷藏1～2 h，2 000 g离心5 min，去除上层脂肪。

若为脱脂样品则直接用于DNA提取。

1.2.2　DNA的提取乳制品中DNA含量低，因此称取脱脂后样品1 g放入50 mL离心管中，之后按照提取试剂盒说明书中的步骤进行操作，最后用50 μL无核酸酶水洗脱，洗脱步骤可分多次洗脱，以提高回收率。

实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

１３仪器．
进口ｌ１ｌ为农业大国。国必须加强对动物源性饲料。作我建立能够快速、确鉴别检测饲料中鸡源性成分的方准
法。本研究采用常规ＰＲ方法和实时荧光ＰＲ方法ＣＣ
检测饲料巾鸡源性成分法的灵敏度高．用性强。方实
宁省
采Ｐ。公。ＭｎＡｕｃｎ用ｇ司ａｔＮＰｆｉ … “ ｇｉ ……ａ。６ ’ ｅＤｉｔ …“ ｍａ的 …… … ｃ …“ ｉ。
实时荧光ＰＲ扩增反应具体条件：５℃ ３、Ｃ９０Ｓ
穆春、孙屏、刘岑杰、徐建平，单位及通讯地址同第一作者。杨滴、夏元凤，大连标准检测技术研究中心。收稿日２１— ２Ｏ期：０００一ｌ
引物合成及探针合成、标记购自ＴＫＲａａａ大连宝
生物公司，实时荧光ＰＲ引物序列及探针的序列见Ｃ表１常规ＰＲ引物序列及扩增长度见表２；Ｃ。１模板ＤＡ的提取．５Ｎ
适用于鸡源性成分的检测
《饲髑工业》２１第３卷第７期・００年１
实时荧光ＰＲ和常规ＰＲ方法ＣＣ检测饲料中鸡源性成分
刘彦泓穆春孙屏杨滴刘岑杰夏元凤徐建平
摘要
根据鸡线粒体ＤＡ序列，计并筛选了鸡源性特异引物及探针，立了饲料中鸡源性Ｎ设建
应试剂盒（ｒｍｘｘａＴ、０ＰＲ缓冲液／ＴＰｅｉＥｑ）１ｘＣＴＭｄＰ溶液、ＮＥＴｑＮｘａＤＡ聚合酶、０ｋｒ１０ｂＭａｅ（ｐ片段大小分别为１００、

应用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR溶解曲线检测鹌鹑源性成分

文章编号：２８７３（００１－００００５ — ０３２１）７０７－３
２００４年以来，随着数个国家高致病性禽流感的
术鉴别检测鹌鹑源性成分的方法。
１材料与方法
１１材料．
相继发生，除鸡以外已波及到人、天鹅、猫等的死
业部也将其列为一类传染病『２ｌ。
目前，主要的动物源性成分鉴别检测的方法有
１１１样品的采集及处理．．
本实验所用鹌鹑、鸵
鸟、、鹅鹧鸪的肌肉样品和鹌鹑肉骨粉样品由中华人民共和国深圳检验检疫局提供；、、、、、鸽鸡鸭马牛
亡，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类肉食品及饲料的安全性已关系到人类的安危。禽流感
（Ｉ被国际兽疫局（Ｉ定为Ａ类传染病，被列Ａ）ＯＥ）并入国际生物武器公约动物类传染病名单＿。我国农１１
摘要：据ＧｅＢｎ根ｎａｋ中的鹌鹑线粒体ＤＮＡ（ＤＮＡ）２ｍｔ１ＳＲＮＡ基因保守序列，Ｐｉｒ．用ｒ５０软件设计了１对针ｍｅ
对鹌鹑的特异性扩增引物，立了一种检测鹌鹑动物源性成分的ＳＢＧｒｎＩ实时荧光Ｐ建ＹＲｅｅＣＲ方法。过ＳＢ通ＹＲ
麓溪豢翥・ｅ囊ｅ镪ｌ０一ｓ
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实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量

实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量作者：谭波杨春萍刘小玲来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。

以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因，LcoR为内参基因分别合成引物及探针，优化反应条件，评价该方法的特异性和灵敏度。

采用实时荧光PCR相对定量法，以△Ct值与2△△Ct值线性模型分别建立回归曲线，通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。

结果表明：目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增，具有特异性，对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL-1。

以△Ct值与2△△Ct值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7（R2= 0.998）、y=0.712 2x+3.050 4（R2=0.988 7）。

两个方法检测35%～90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%～102.52%、98.55%～106.30%。

将两种定量方法进行数均处理，回收率的偏差减少。

本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性，并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析，对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。

关键词：肉制品；牛源性成分；实时荧光定量PCR；相对定量中图分类号：TS 251.5 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0006-09DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.002Detection of the Bovine-derived Materials and Their Contents inMeat Products by Real-time Fluorescence Quantitative PCRTAN Bo1，2， YANG Chun-ping3， LIU Xiao-ling1*（1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004， China;2. Guizhou Research and Application Center of Detection Technology， Guiyang， Guizhou 550014， China;3. Guizhou Institute of Analysis and Testing， Guiyang， Guizhou 550014， China）Abstract： In order to establish a rapid， efficient， accurate and low-cost method for the identification and quantitative detection of the bovine-derived materials in meat products， the primers and probes were synthesized with the single-copy gene of cell nucleus， bosPDE as the target gene and LcoR as the internal reference gene， to optimize the reaction conditions and evaluate the specificity and sensitivity of the method. By using the relative quantitative method of real-time fluorescence PCR， the regression curves were respectively established with the linear model of △Ct value and 2△△Ct value， and the accuracy of the method was evaluated by simulating artificially the mixed beef samples. The results showed that： the bosPDE primer of the target gene only amplified the DNA of beef， which was specific， and the sensitivity of amplification to beef DNA could reach 0.01 ng·μL-1. The regression curves with △Ct value and 2△△Ct value as the quantitative indexes were y=-3.096 5x+8.479 7 （R2=0.998） and y=0.712 2x+3.050 4 （R2=0.988 7）， respectively. The recovery rates of the artificial simulated mixed beef samples with 35%-90% beef content detected by the two methods were 94.30%-102.52% and 98.55%-106.30%， respectively. The deviation of recovery rate was reduced when the number-average treatment was carried out on the two quantitative methods. The real-time fluorescence quantitative PCR method established in this study could accurately characterize the bovine-derived materials in meat products， and could be used for the relative quantitative analysis of beef in the beef adulterated products. It had important reference value for identifying the adulteration of meat products and quantifying the concentrations of components in beef products.Key words： Meat products； Bovine-derived materials； Real-time fluorescence quantitative PCR； Relatively quantitative近年来，随着全球化经济的高速发展，人们的物质需求逐渐提升，各种肉类食品的流通和交易也越来越频繁，这使得一些不法商家为了牟取暴利，以低价肉替代高价肉，导致肉制品掺假事件频繁发生［1-3］。

黄牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法编制说明

编制说明项目名称：黄牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法项目编号：内质监标函〔2018〕307号编制单位：锡林郭勒职业学院一、工作简况本项目来源于2018年第3批内蒙古自治区地方标准制修订项目（内质监标函〔2018〕307号）。

起草单位为锡林郭勒职业学院，协作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。

主要起草人：郭梁、雅梅、海小、钱俊平、刘国强、罗建兴。

二、制定标准的必要性和意义牛肉和猪肉深受消费者的喜爱，是农畜产品市场中重要组成部分。

市场中存在用低价肉冒充牛肉等高价肉的欺诈违法行为，而且牛肉和猪肉涉及民族文化和宗教信仰，亟需制定针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法。

目前，已经存在八项黄牛和猪源性检测方法标准：饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法（GB/T 25165-2010）；动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法PCR方法（GB/T 21104-2007）；饲料中牛羊源性成分检测实时荧光聚合酶链反应法（NY/T 1946-2010）；食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法（SN/T 2051-2008）；动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法（SN/T 2980-2011）；动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法（GB/T 21101-2007）；食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法（SN/T 3730.8-2013）。

在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法的相关标准。

本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的黄牛和猪源性成分同步检测方法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。

荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用

动物医学进展,2005,26(2):13217Progress in Veterinary Medicine荧光定量PCR技术及其在动物传染病定量检测中的应用3肖国生,曹三杰,文心田(四川农业大学动物科技学院,四川雅安625014)中图分类号:S855文献标识码:A文章编号:100725038(2005)022*******摘　要:荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合,而荧光探针是荧光定量PCR的核心。

目前报道的荧光探针主要有Taq Man、Amplisensor、分子信标、Lightcycler 以及在这4种探针基础上发展起来的其他荧光探针。

各种荧光探针在定量PCR中的作用是识别和报告特定核酸。

这些荧光探针与相应的靶分子杂交时经历一个自发荧光形成或消失的构象变化,只有与完全互补的靶核酸杂交时才会出现这种变化,当靶核酸存在碱基错配或缺失时,荧光探针就不会与之杂交,也不会出现荧光的变化。

在检测时根据这种荧光变化来确定检测中特定核酸的存在和量的多少。

荧光探针用于定量PCR不但提高了PCR的检测灵敏度,还能在同一封闭管中对模板进行准确定量检测,特别适合特定核酸扩增的实时监测。

荧光定量PCR用于动物传染病的诊断,不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点。

关键词:荧光定量PCR;荧光探针;动物;传染病;诊断聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因的方法,也是进展最快、应用最广、简单易行的体外基因扩增技术。

PCR通过重复模板链变性,引物退火,聚合酶延伸3个步骤,对目的基因或基因片段进行扩增,理论上目的基因数量在每个温度循环后将增加1倍,经20次～30次循环后,被扩增的基因数可达106以上,其敏感性相当高,任何痕量样品都可得到扩增,因此被广泛应用于临床病原微生物的诊断领域。

荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应用

荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应用
荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR）是一种实时监测DNA及RNA扩增
过程并量化扩增产物，这种反应把一种无荧光探针或荧光标记后的探针添加到反应组分中，同时，该探针会特异性结合样品中的特性序列，从而实现荧光信号的产生。

当扩增的反应
产物的数量与样品的终末浓度呈正比时，荧光定量聚合酶链反应就可以推断出样品中特异
性序列的存在性。

荧光定量PCR技术由聚合酶链反应（PCR）和荧光定量技术结合而成，可用于快速，
准确，灵敏地检测动物DNA及RNA水平，尤其是病原体检测，比如病毒、细菌及其他微生
物等。

目前荧光定量PCR技术被广泛应用于动物疫病检测，其核心技术是根据病原体的特性
序列选择特异性探针，在设计制备的PCR 试剂盒中添加其它必要成分，在特定的温度及时间范围内反复扩增，其最终结果可以在实验过程及最后结果中反映出，能够更精确的检测
到一些低检出限的病原体，有效提高检测速度和准确性。

荧光定量PCR技术在动物疫病检测中有以下优点：1.检测灵敏度高，能够以少量样品
快速、准确检测出病原体定量；2.试剂、耗材及仪器成本低廉，可有效节约检测成本；3.
可以同时实现多项检测，样品及检测条件敏感；4.实时荧光反应可以直接在PCR反应完
成时监测样品中扩增片段的变化。

总之，荧光定量聚合酶链反应技术已经成功的应用于动物疫病检测，其良好的检测性能，低廉的成本，实用性强及可靠性，使其在动物疫病领域中地位日益显著。

动物荧光定量PCR检测方法

动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒一、实验前准备（一）、分装反应液（以鸡鸭源为例）１、将反应液（GA）与Bst聚合酶离心15s，取出，在反应液中加入Bst聚合酶全部加入到反应液（GA）中离心15s，将其分装小管中，每个管分23µL。

一般分到24-26个。

2、分装完毕，取密封液加入每个小管中各一滴（所取密封液的枪一定要竖直加入）。

3、全部完毕后将其和试剂盒放到-20℃冰箱中保存。

:注：①每一种试剂盒中，出来反应液与对应的阳性对照不可混用外，其他三种均可通用。

②每一试剂盒中都有反应液、Bst聚合酶、密封液、阴阳对照五种试剂。

（二）、试验中试剂的准备1、Proteinase K：加入600µL Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中，颠倒混匀使蛋白酶K充分溶解，保存于-20℃。

2、Buffer GW1：加入14mL无水乙醇。

3、Buffer GW2：加入40mL无水乙醇。

注：每一种试剂盒上都有相应的说明。

Buffer GW1和Buffer GW2加入无水乙醇的量按说明书操作。

二、动物组织DNA提取1、取30-100µL Buffer AE（这是一个样品的量，具体量取决于自己做的实验样品的个数），于70℃中预热，备用。

2、取1-20mg的样品，将其剪切成尽量小的碎片，转移到1.5mL的离心管中。

加入230µL Buffer MTL和20µL Proteinase K，涡旋混匀。

55℃水浴1-3h（具体时间看样品的消化情况）。

水浴期间要时常将样品涡旋混匀。

注意：取样量不可以太多，过多会降低产量与纯度。

脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。

肌肉和皮肤可相应增加到30mg。

3、加入5µL RNase Solution（RNA裂解酶）（枪身不要碰着RNase Solution）至消化液中，涡旋混匀。

实时荧光PCR检测食品肉类种源的方法探讨

分析与检测1　PCR检测技术概述1.1　PCR技术简介PCR技术始于1985年，其用于特定的DNA片段的快速检测，与传统的检测方法相比，能够对特定的成分进行快速检测，并能够快速检测出目标物质中的不同成分，因此，该技术在目前的食品成分检测和致病菌检测等多方面均得到了越来越广泛的应用[1]。

1.2　PCR技术的优势传统的成分检测环节往往需要大量的人力物力，且操作的复杂程度高，由于各种成分的生物特性和化学性质都有着一定的区别，对各个成分进行分别鉴定时，经常需要多次调整环境的pH、温度等参数，任何一个环节的失误都可能导致前功尽弃，而PCR技术的应用，有效解决了上述问题[2]。

具体来看，PCR技术主要表现出以下两方面的优点：①便利性好，与传统方法相比，PCR技术只需使用较少的设备和常规的操作步骤即可实现检测，整个过程更加便捷；②速度快，可以短期进行大量的检测[3-4]。

2　食品中肉类种源的实时荧光PCR检测2.1　实验材料2.1.1　实验试剂实验试剂包括琼脂糖、GelRed染色剂、50 bp DNA Ladder、无水乙醇、DNA提取试剂盒、DreamTaq PCR Master Mix，以及市售的牛肉卷样品和牛肉。

2.1.2　实验仪器实验仪器包括高速冷冻离心机、恒温水浴槽、涡旋振荡器、电子天平、生物分光光度计、制冰机和实时荧光PCR仪。

2.2　实验方法2.2.1　样品处理及基因组模板制备首先，采用剪刀和研钵，将所购买的样品剪碎和研磨，以进行匀质处理，其中，牛肉样品需要先在105 ℃下烘干，而后再进行均质处理。

两种样品的均质处理，应当保持一定距离，分开进行，避免交叉污染。

在均质处理步骤完成后，按照DNA试剂盒上的说明进行后续操作，以获取OD260/OD280比值处于1.7～2.0区间内的动物组织DNA。

2.2.2　引物与探针的合成及有效性验证根据Genbank所公布的基因序列，并通过Meglign软件进行对比分析，选取匹配度低和差异大的序列片段，并使用primer express2.0软件，在引物探针设计原则指导下，设计牛源成分的特异性引物和探针。

实时荧光PCR法检测肉制品中鸡、鸭源性成分

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｔｏｄｅｔｅｃｔｃｈｉｃｋｅｎａｎｄｄｕｃｋｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｄｅｓｃｉｒｂｅｄ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｃｈｉｃｋｅｎａｎｄｄｕｃｋｍｉｔｏｃｈｏｎｄｉｒａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｗｅｈａｖｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓ —
摘
要：根据鸡、鸭线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）序列设计了鸡、鸭特异性引物及Ｔａｑｍａｎ探针，建立了肉制品中鸡、鸭源性
成分的实时荧光聚合酶链式（ｒｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲ）检测方法。结果发现：利用此方法，两种动物源性的最低检出限值（质
ｂｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｈｉｃｋｅｎａｎｄｄｕｃｋｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ — ｔｉｍｅＰＣＲ；ｃｈｉｃｋｅｎｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ；ｄｕｃｋｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ；ｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔ
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｆｏｒｉｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｃｋｅｎａｎｄｄｕｃｋｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔ

实时荧光定量PCR技术在畜禽肉类检测中的应用

T logy科技食品科技肉类是人类获取蛋白质的主要来源之一，其中的营养物质是维持人类生命活动所必需的。

从蛋白质水平和核酸水平上对肉类成分进行分析已经成为解决肉类掺假问题的主要手段。

在蛋白水平上，常常通过液相色谱、ELISA（酶联免疫吸附反应）以及高效液相色谱等对样品的成分进行分析。

但这类方法在检测加工样品时的特异性、准确性较差，且对检测样品的处理和仪器的要求较高。

在核酸水平上进行检测时，由于DNA的稳定性和特异性可以较为准确的对待测样品的成分进行分析。

目前这类检测方法中的DNA 探针杂交、普通PCR、限制性片段长度多态性扩增以及荧光定量PCR在肉类来源的检测中应用的较多[1-4]。

1　荧光定量PCR技术的检测原理聚合酶链式反应（PCR）最早是KaryMullis在分析疾病基因时发明的[5]。

而荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上，将能够发出荧光信号的探针或染料与引物一起加入到反应体系中，根据碱基互补配对原则进行半保留复制，通过对荧光信号的收集达到实时监控PCR过程的目的[6]。

该方法在封闭的体系中进行扩增和实时监测，无需电泳就能得出结果，且在一定程度上避免了检测样品之间的交叉污染。

同时，荧光定量PCR的模板序列较短，可以缩短检测时间，快速得到检测结果。

而根据产生荧光信号方式的不同，荧光定量PCR技术可分为Taq Man 探针法和SYBR Green I荧光染料法。

2　荧光定量PCR技术在肉制品检测过程中的应用使用实时荧光定量PCR技术对肉制品肉源的检测主要是检测动物细胞中线粒体相关基因。

众所周知，线粒体DNA是细胞质遗传的，具有含量多、分裂快等优点，同时不同组织部位中线粒体DNA的含量具有很大的差异。

因此对肉制品中肉种类以及数量的检测通常选用线粒体基因。

此外，相比较核基因，线粒体基因的检测具有较高的灵敏度和稳定性。

常用作检测肉类来源的线粒体基因主要是细胞色素b基因、细胞色素c氧化酶亚基基因和线粒体D-loop区域的基因[4，7]。

实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证

QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
质量安全与检验检测Vol.31 No.2 2021年第2期
米、大豆、花生均为超市购买。
2.2主要试剂
动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒
（DP323-02）（天根生化）。
鸡种特异性基因测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江）。
2021 年第 2 期 Vol.31 No.2
质量安全与检验检测 QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证
徐美鑫张澜相茂花
(日照市场监管检验检测中心山东日照276800)
摘要本文以鸡源性成分为例，研究了 GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》的定性方法验证，以证明该方法的可行性及适用性，以期为基因扩增检测领域的方法验证工作提供参考。验证参数为DNA提取效果评价、重复性、检出限和基质效应。结果显示,DNA提取效果良好，不存在抑制剂；该方法重复性较好；基质效应无影响；检出限为0.1%。各参数均满足标准的要求，该方法具有较好的可行性及适用性。
与验证指南》要求，并参考RB/T 004-2019《转基因
检测方法验证指南＞[2],以鸡源性成分为例研究GB
38164-2019《常见畜禽动物源性成分》方法验证，验
证了该方法的DNA提取效果评价、重复性、检出限
和基质效应。
3.2 DNA提取质量
使用DNA提取试剂盒对现杀整鸡进行DNA提
取,PCR体系配制及反应参数按照鸡种特异性基因测定试剂盒进行操作。
注:பைடு நூலகம்D—未检出
4.3检出限通过量化样品中核酸的最小检测量来评估检出

实时荧光定量PCp定量检测肉制品中牛羊猪源性成分

66·FOOD INDUSTRY调查研究　刘敏黄小凯胡秀红温州市质量技术监督检测院实时荧光定量PCR定量检测肉制品中牛/羊/猪源性成分实验获得结果进行数据分析，三种化合物在２０￣２０００００拷贝数范围内线性关系良好，相关系数均大于０．９７。

其中各种源性线性如下：牛源性ｙ　＝　－３．２１６ｘ＋４１．０８猪源性ｙ＝－３．１４０ｘ＋３９．５２羊源性ｙ＝－２．５９０ｘ＋３７．４１动物源性ｙ　＝　－３．３１２ｘ＋４０．４９注：其中ｘ＝ｌｏｇＺ，Ｚ为模板ＤＮＡ的起始拷贝数。

结果计算。

根据标准曲线可以求得样品中牛／羊／猪和动物源性基因的起始拷贝数，样品中牛／羊／猪占动物源性基因含量按式（１）进行计算ｗ＝Ｚ１／Ｚ２　＊１００％　＊ｋ………………（１）ｗ——样品中牛／羊／猪占动物源性基因含量（％）；Ｚ１——牛／羊／猪基因起始拷贝数（ｃｏｐｉｅｓ）；Ｚ２——动物基因起始拷贝数（ｃｏｐｉｅｓ）；ｋ——校正因子，ｋ值为实际阳性控制ＤＮＡ百分值／计算所得ＤＮＡ百分值，１００％／ｗ。

检出限、精密度和回收率。

２０和２００，０００起始拷贝数的标准物质的扩增曲线明显，阴性对照无明显扩增曲线，仪器的检出限可以达到０．０１％。

结合实际样品及ＤＮＡ提取等因素，本方法的检出限可以达到１％。

按照重量配比，在不含目标源性混合肉中分别掺入１％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）和５０％（ｗ／ｗ）的目标源性肉类，再取一个纯肉样品，分别进行６个平行的测定，获得６个平行的实测数值。

通过计算检出限为１％，精密度小于１０％和回收率在８５％－１１０％之间。

本方法建立了牛／羊／猪源性成分的定量曲线，实现了肉制品中牛／羊／猪源性的相对定量，通过优化实验步骤和方法，使得检测时间短、精度较高、稳定性较好。

该方法也为制定相关检测方法标准提供参考。

基金项目：温州市科技局立项项目（基金编号为S2*******）类源性成分鉴定的方法多种多样，国内外在基因水平上对肉类源性成分进行鉴定的方法也越来越多。