第三章 固定化酶
第3章 固定化酶催化反应过程动力学
此时，对此微分方程需要根据不同酶动力学特征进行求解。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时， rS =
r ) R ，其中φ＝ R 3 r sinh(3φ )
rmax CS ，可解得： Km
CS = CS 0
R sinh(3φ
rmax 。 Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时， rS = rmax ，可解得：
φ1
，其中φ1＝L
rmax Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时，可解得：
对于球形固定化酶，η0＝1 − （
Rc 3 ） ， R L 对于膜片状固定化酶，η0 = 1 − c 。 L
当酶反应动力学方程符合 M－M 方程时，无解析解，仅有数值解。 15、梯勒模数φ（Thiele modulus）是表示固定化酶内扩散影响的重要无因次模 型参数，其物理意义为 φ＝ 表面浓度下的反应速率 。φ值越大，表明内扩散速率 内扩散速率
游离酶 空间效应 本征速率和动力学参数 改变的本征速率和动力学参数 分配效应 固有速率和动力学参数 扩散效应 宏观速率和动力学参数 固定化酶
4、固定化酶催化反应外扩散效应。固定化酶与溶液中底物反应过程包括三步： （1）底物从液相主体扩散到固定化酶表面； （2）底物在固定化酶表面进行反应； （3）产物从固定化酶表面扩散到液相主体。其中酶催化反应速率可由 M－M 方 程 表 示 RSi =
CSi Km r ，＝ K ，定义Da= max CS 0 CS 0 k L aCS 0
2 CS ⇒ CS +（K＋Da-1） CS − K＝0 K + CS
1 − CS＝Da 可得：
−a ± a 2 + 4 K 解一元二次方程可得： CS＝ ，其中a = K＋Da-1 2 当 a>0 时，取“＋”号，当 a<0 时，取“-”号。 （2）有效因子η E 求解。 由定义可知：ηE = 因此， RSi = RS 0ηE
第三章 固定化酶反应动力学
•反应的总过程为外部传递和表面反应两者的集中反映，反 应的有效速率既与底物的传质系数有关，又与反应的动力 学参数有关vmax和Km。 •动力学控制：传质速度相当快，反应主要受到酶的催化反 rmax cso 应。
Rsi
•扩散控制：酶的催化效率很高，底物的传质速率很慢。
K m cso
rso
Rsi k L a(cso - csi ) k L acso rd
颗粒内无浓度梯度影响时的反应速率：
dcs Rs 4R De dr r R
2
4 3 4 3 rmaxcso Rsi R rso R 3 3 K m cso
第三章 固定化酶反应动力学
（3）一级反应动力学内扩散有效因子
R 若引入：r r / R，cS cS / cS 0，并令：1 3 则该方程式变为：
d cS 2 dcS D （ ） rS e 2 dr r dr
2
k1 , rS k1cS , De
d cS 2 dcS 2 9 1 cS 2 dr r dr
2
边界条件：r 1处，cS 1； dcS r 0处， 0。 dr
第三章 固定化酶反应动力学
cS cS 0
2
d cS 2 dcS D （ ） rS e 2 dr r dr
2
第三章 固定化酶反应动力学
（2）内扩散效率因子
Rs 颗粒内实际有效反应速 率 颗粒内无浓度梯度时的 反应速率 Rsi
在稳定状态下，球形固定化酶颗粒内的实际有效反应速率应等 于从颗粒外表面向微孔内的扩散速率，即：
第三章 固定化酶反应动力学
Байду номын сангаас
1
最新第三章--固定化酶及反应动力学0教学讲义PPT课件
内容
概述
固定化后酶性质变化及动力学影响因素
外扩散限制效应 内扩散限制效应差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力 ，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高 ，而且难于连续化生产。
产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
吸附（载体结合）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合 （离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶 影响加大。
交联法：利用多功能试剂使酶间交联（异氰酸酯，联苯胺，形成 共价键）。
包埋法：包埋于高分子凝胶网格（网格型），高分子半透膜（微 囊型）（医学应用多）
01 概 述
酶的固定化技术和固定化酶
01 概 述
工业规模的酶固定化方法应具备的条件： (1) 载体价廉、固定化费用低； (2) 能反复利用，即对非一次性固定化酶，其载体要求能再生； (3) 固定化收率高、制备简便、而且结合力强； (4) 载体的机械强度高； (5) 物理及化学性质稳定，使用于食品加工时要安全无毒．
01 概 述
固定化酶制备方法
酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
1 吸附法
吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 (1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物
第三章 固定化酶 (1-3节)
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团
然后活化该活泼基团
关键
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
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A．重氮法
反应示意式如下
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A．重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯 磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖 凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
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A．重氮法
反应式及原理
退出
B 叠氮法
例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白
酶，步骤如下：
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
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B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与 亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二． 固定化酶的性质
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
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2 ．固定化后酶稳定性提高的原因：
（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method）
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（一） 吸附法
1． 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体
吸附在其表面上。
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。
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（二）结合法 1 离子键结合法 2 共价键结合法☆
第三章 固定化酶催化反应过程(wfw)
界面内侧的底物浓 度为Csg，界面外侧的 底物浓度为Csi,则分配 系数K为： K=Csg／Csi
Cso—液相主体的浓度， Csi——外扩散造成的界 面外侧浓度。 Csg—由分配效应造成 的微环境的底物浓度。
静电效应的影响表现在对Km值的影响。 通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物 在溶液中也会离子化，这样在固定载体上的电荷和移动 的离子之间，常会发生静电交互作用，产生分配效应。 使底物或产物浓度之间出现不均匀分布。
(生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统, 可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质 )
• 固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种, 将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试 纸上,只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检 测出尿样的葡萄糖是否超标,从而断定该妇女是有血糖、 尿糖还是妊娠。 • 生化分析中最常用的H电极也绝大多数是固定化酶产品:固 定化青霉素酶电极 • 重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品 • 用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。
微囊型
特点:固定化酶颗粒一般为直径 是几微米到几百微米的球状体，比 网格型颗粒小得多,有利于底物和 产物扩散;半透膜能阻止蛋白质分 子渗漏和进入，注入体内既可避免 引起免疫过敏反应，也可使酶免遭 蛋白水解酶的降解，具有较大的医 学价值.但反应条件要求高，制备成 本也高。
制备方法:界面沉淀法、界 面聚合法、二级乳化法和脂质 体包埋法等.
根据Boltzman分配定律，分配系数K为
ZFU K exp( ) RT
Z--底物分子所带电荷；F--法拉第常数；U--静电电势。 当载体与底物所带电荷相反时，即Z为正、 U为负 时，K大于1; 当两者带有相同电荷时，则K小于1。
2019-2020沪科版生物选修1第3章 第4节 酶的固定化
第四节酶的固定化一、固定化酶1．含义通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。
2．方法(1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。
(2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。
(3)物理吸附法。
3．优点(1)固定化酶的活性稳定，可反复使用；(2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化；(3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化；(4)极大地降低了生产成本。
4．缺点需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。
二、固定化细胞1．含义用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。
2．优点比固定化酶更简捷，使用寿命更长。
三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4 ℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。
一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较(1)固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。
(2)固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。
二、固定化酶的制备及利用1．酶的固定化：(1)18.6%的CaCl 2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。
(2)3.65 mol/L 的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。
(3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。
(4)0.1 mol/L 的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。
(5)放入1 mg/mL 的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。
2．检验酶的活性：(1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min)(2)用双缩脲试剂检验3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质(1)细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是_________________________________________________________。
反应工程第三章 固定化酶反应过程动力学.
rso
•外扩散控制：酶的催化效率很高，底物的传质速率很慢。
R si k La(Cso - Csi ) kLaCso rd
•介于上述两种情况之间
第三章 固定化酶反应动力学
Rsi总是接近于动力学反应速度和扩散速度两者中比较小的那个。
Rs rso
rd Rsi
主体浓度co
第三章 固定化酶反应动力学
2.0×10-4
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.3影响固定化酶促反应的主要因素
1）分子构象的改变
溶液酶
分子构象改变
2）位阻效应
第三章 固定化酶反应动力学
溶液酶
位阻效应
3）分配效应
第三章 固定化酶反应动力学
宏观环境
cS0 cSg
cSi
由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶 载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象称为分 配效应。
E
有外扩散影响时的实际 反应速率 无外扩散影响时的固定 化酶外表面处的反应速
率
R si rso
R si
rmax csi Km csi
rso
rmax cso Km cso
E
cs (1 K) cs K
cs csi / cso
Km
Km cso
Da rmax k Lacso
第三章 固定化酶反应动力学
3.3.2 颗粒内的浓度分布与有效因子
（1）颗粒内的浓度分布
第三章 固定化酶反应动力学
De
(
dcS dr
4r2 )
r r
D
e
(
dcS dr
固定化酶
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第四节 微生物、植物和动物细胞固定化
细胞特性比较
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
对剪切力
敏感
色素、药物、香 精、酶等
反应式及原理
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A．重氮法例
5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得 到四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国 科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业
生产的固定化酶）
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B 叠氮法
例
用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：
⑴ 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中 通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。
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（三）交联法的形式
交联法有2种形式： 酶直接交联法
酶辅助蛋白交联
双重固定法
（1） 吸附交联法
（2） 交联包埋法
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酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、 溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的 平衡。
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酶辅助蛋白交联
为避免分子内交联和在交联过程中因化学修 饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白 质.
（四） 包埋法（entrapping method）
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酶和细胞固定化示意图
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（一） 吸附法
第三章 固定化酶反应动力学
•反应的总过程为外部传递和表面反应两者的集中反映，反 应的有效速率既与底物的传质系数有关，又与反应的动力 学参数有关vmax和Km。 •动力学控制：传质速度相当快，反应主要受到酶的催化反 rmax cso 应。
Rsi
•扩散控制：酶的催化效率很高，底物的传质速率很慢。
K m cso
rso
Rsi k L a(cso - csi ) k L acso rd
Z-底物分子所带电荷 F-法拉第常数 U-静电电势 R-气体常数 T-绝对温度 cSg-界面内侧底物浓度 cSi-界面外侧底物浓度
rS rmax
c Sg c Sg K M
c Si exp( ZFU / RT ) rS rmax c Si exp( ZFU / RT ) K M c Si rS rmax KM c Si exp( ZFU / RT ) c Si rS rmax c Si K ' M
第三章 固定化酶反应动力学
3.1 固定化酶反应动力学的特征
3.1.1 酶的固定化技术
交联
利用双功能试剂的作用，在酶分子间发生交联，凝集成网 状结构，构成固定化酶；
载体结合法
酶或细胞利用共价键或离子键、物理吸附等方法结合于水 不溶载体；
包埋
将酶包埋在凝胶的微细格子中或半透性的聚合膜所包埋， 使酶分子不能从凝胶的网格中漏出。
3.3.3影响固定化酶促反应的主要因素
1）分子构象的改变
溶液酶
分子构想改变
第三章 固定化酶反应动力学
2）位阻效应
溶液酶
位阻效应
第三章 固定化酶反应动力学
3）分配效应
宏观环境
第三章 固定化酶反应动力学
霉学 第三章 固定化酶
二、固定化酶的制备方法
• (一) 吸附法 • （二）包埋法 • （三）共价结合（偶联）法 • （四）交联法 • （五）四种固定化酶制备方法的特点小结
Hale Waihona Puke 固定化酶的制备方法的选择• 固定化酶的制备方法、制备材料多种多样， 不同的制备方法和材料，固定化后酶的特 性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自 身的性质、应用目的、应用环境来选择固 定化载体和方法。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固 定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶 能有效回收贮藏，利于反复使用。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这 要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度， 才能使之在制备过程中不易破坏或受损。
（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效 率和产物的量。
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于
DL-AA的光学分析。
（二）、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ：
先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的 酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就 在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高， 并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联 到高聚物上，可以减少酶的脱落。
固定化酶
（Immobilized Enzyme）
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而 且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。
针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶 或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚 在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃 的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶。
第3章 固定化酶催化反应动力学
3.1 固定化酶的制备方法
交联法
交联法：它是用双功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方 法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，不同 的是它不使用载体。
交联剂有：戊二醛（形成希夫碱） 异氰酸脂（形成肽键） 双重氮联苯胺（发生重氮偶合反应） 此法反应条件比较激烈，酶活回收率低。
3.1 固定化酶的制备方法
Rsi，可采用两种方法求出：
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
( 1 )由 C si值确定 Rsi。因为根据式（ 3－8），可得出下式： rmax Csi Cs 0 − Csi = ⋅ k L a Km + Csi ( 3−13 ) 引入 C s＝ C si / C s 0， = K m / Cs 0 K 并定义 Da = r max ( 3 − 14 ) k L ⋅ a ⋅ C s0 Cs K + C s ( 3−15 )
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
假定对一非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合 M-M方程，即：
r max⋅ Csi (3 − 6) Rsi = Km + Csi 式中：Rsi — 底物在固定化酶外表面 上的消耗速率，又称 宏观反应速率， mol /( L ⋅ s ) Csi — 底物在固定化酶外表面 上的浓度，mol / L。
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
定态条件下，应存在Rsi=Rsd，即
r max⋅ Csi ( 3 − 8) kLa ⋅ (Cs 0 − Csi) = Km + Csi
该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物反应 速率。 (1) 当外扩散传质速率很快，而固定化酶外表面反应速率相对较慢时, 并成为该反应过程速率的控制步骤时，酶的外表面上底物浓度应为 液相主 体溶液的浓度，即为CS0，此时的反应速率应为：
高三生物固定化酶知识点
高三生物固定化酶知识点生物固定化酶是一种将酶固定在载体上的技术，被广泛应用于生物工程和工业生产中。
通过固定化酶，可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性，以达到更高的产量和效率。
本文将从固定化酶的原理、方法和应用领域等方面进行探讨。
一、固定化酶的原理固定化酶的原理是将酶通过化学交联、吸附或共价键结合等方法与载体材料结合，形成酶固定化的复合物。
这种复合物在特定条件下可以实现酶的固定化，成为一种高效的酶催化系统。
固定化酶的原理主要基于两个方面：一是通过酶与载体的物理或化学结合，增强酶的稳定性，延长其半衰期；二是通过载体的特性改变酶的反应环境，提高酶的催化效率。
二、固定化酶的方法固定化酶的方法主要分为三类：物理吸附法、化学固定法和共价固定法。
物理吸附法是将酶与载体通过静电相互吸引力、疏水效应或表面张力等物理力作用结合在一起。
这种方法简单易行，但不稳定，酶容易从载体上脱落。
化学固定法是利用肽键或二硫键等化学键的形成，使酶与载体牢固地结合在一起。
这种方法稳定性较高，但需要进行特定的化学修饰和反应条件控制。
共价固定法是通过酶分子上的特定官能团与粘接剂反应，形成共价键结合。
这种方法稳定性最高，但操作较为繁琐。
三、固定化酶的应用领域固定化酶广泛应用于医药、食品、环境工程等领域。
在医药领域，固定化酶可以用于酶替代治疗，例如胰岛素固定化酶用于糖尿病治疗。
此外，固定化酶还可以用于制备药物中间体和药物合成等过程中，提高反应效率和纯度。
在食品领域，固定化酶可以用于食品加工和酿造过程中的酶催化反应。
例如，酶固定化技术可以用于啤酒生产中的淀粉糖化、果汁酶解和乳酸酶发酵等工艺。
固定化酶可以提高生产效率和产品质量。
在环境工程领域，固定化酶可以用于废水处理、大气污染物降解和土壤修复等方面。
通过固定化酶技术，可以降低酶的使用成本和环境污染，同时提高反应效率和降解效果。
结语生物固定化酶是一项重要的生物工程技术，通过固定化酶可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性。
高中生物苏教版高二选修1课件：第三章_第二节_固定化酶的制备和应用
1．直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的 一种或几种
种类
一种
一系列酶
常用 载体
纤维素、琼脂糖、硝 明胶、琼脂、海藻酸
酸纤维素、聚丙烯酰 钠凝胶、角叉菜胶
胺凝胶
一分耕耘一分收获
项目 直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
制作方法
物理吸附法、化学 包埋法、物理 结合法、包埋法 吸附法
一分耕耘一分收获
固定化酶和固定化细胞的原理、作用
[例 1] (江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙
述，正确的是
()
A．可用包埋法制备固定化酵母细胞
B．反应产物对固定化酶的活同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
一分耕耘一分收获
[思路点拨]
一分耕耘一分收获
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a 代表________，
b 代表________。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原
因是__________________________________________________。
为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程
质，反应效率下降
一分耕耘一分收获
酵母菌细胞的固定化技术
一分耕耘一分收获
一分耕耘一分收获
1．酵母细胞固定前要活化，原因是什么？ 提示：在缺水状态，微生物处于休眠状态。活化就是让处于 休眠状态的酵母细胞恢复正常的生活状态。 2．为什么麦芽汁可以被质量分数为 10%的葡萄糖溶液替代？ 提示：酵母菌也可以利用葡萄糖作为营养物质。 3．为什么说海藻酸钠适用于多种细胞的固定化？ 提示：用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞，除对细胞无 毒性外，还具有操作简便、条件温和等特性。通过改变海藻酸钠 的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
生物中图版学案：第三章第四节酶的固定化
第四节酶的固定化1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。
2．尝试制备固定化大肠杆菌细胞.一、酶的固定化1．固定化酶概念：通过物理或化学的方法,将水溶性的酶与不溶性的载体结合,使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应，这样制成的酶称为固定化酶。
2．酶的固定化方法共价键结合法:将酶通过化学反应以共价键结合到尼龙等载体上.包埋法：将酶均匀包埋在琼脂糖凝胶等多孔性的凝胶中的固定化方法。
3．固定化酶的特点活性稳定，可以反复使用多次。
在生产中，固定化酶能与反应液相互分开,不与产品混合，制品较易纯化，在大规模生产时所需工艺设备简单易行。
4．固定化酶的实例：木瓜蛋白酶的固定化（1）酶的固定化。
在啤酒生产过程中,刚酿制的啤酒往往含有少量的蛋白质而显得浑浊.加入木瓜蛋白酶,可以使蛋白质水解成氨基酸，供酵母菌增殖所需，从而缩短发酵时间，提高啤酒产量，使酒质澄清醇和。
将尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中，室温下放置10 s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发黏。
取出后用水冲洗，并用吸水纸吸干。
将尼龙布放入盐酸中，室温下水解，用蒸馏水洗至pH中性.再将尼龙布放入戊二醛溶液中，室温下浸泡20 min。
取出后用磷酸缓冲液(pH＝7.8)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干后立即放入木瓜蛋白酶溶液中，4 ℃下固定3.5 h。
取出尼龙布后用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶,即得到尼龙固定化酶.为防止改变酶的电荷,操作过程中不能使用金属镊子。
（2)检验酶的活性。
（3)酶的再利用。
二、细胞的固定化1．细胞固定化技术利用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。
固定化细胞比固定化酶更简捷，使用寿命更长.2．大肠杆菌细胞的固定化可以用液体培养基培养大肠杆菌,取菌液加入生理盐水和琼脂，搅拌均匀，待琼脂凝胶凝固后，切成小块，用生理盐水和蒸馏水洗净，即得到固定化的大肠杆菌细胞。
1．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的比较对固定化酶的作用影响较小的固定方法是物理吸附法.2．固定化微生物细胞利用微生物来生产酶具有生产成本低、周期短、产量大等优点。
第三章 酶促反应动力学(简)-2
内扩散阻力发生在多孔性固定化酶载体的 内部，它是底物传递到固定化酶内部的酶 部位时的一种扩散限制效应。内扩散限制 效应往往与酶催化的化学反应同时进行。 由于微环境内的化学反应造成底物的消耗 和产物的积累，形成浓度的不均匀性。而 在微环境内底物的消耗和产物的积累程度， 也常和这些物质的分子量大小有关。
二、固定化酶促反应中的过程分析
固定化酶促反应过程中，需考虑扩散传质 与催化反应的相互影响，注意外部与内部 扩散的不同传质方式。 内部扩散与催化反应有时是同时进行的， 两者相互影响。外扩散通常先于反应。应 区别对待。
为集中研究外扩散限制效应，常选择液体不能渗透的无 电活性的固定化酶膜或固定化酶颗粒作为研究的模型。
rmax [ S ] Rsi = = rs 0 (2 − 4 − 4) K m + [S ]
1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
(2) 当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速率很快，此时外扩散速率 成为反应的控制步骤。固定化酶外表面上底物浓度趋于零。 故：
扩散最大速率
Rsi = k L a[ S ] = rd (2 − 4 − 5)
3.3 固定化酶促反应动力学
一、 固定化酶催化的动力学特征
1 影响固定化酶动力学的因素 2 固定化酶反应动力学
二、固定化酶促反应中的过程分析
1 外扩散限制对酶催化反应速率的限制 2 内扩散限制效应
酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变 化，而且由于固定化酶的引入，反应体系 变为多相体系，例如液-固体系、气-液-固 体系等。因此在研究固定化酶催化反应动 力学时，不仅要考虑酶催化反应的本征动 力学规律，更要研究反应物的质量传递规 律，研究物质的质量传递对酶催化反应过 程的影响。建立起同时包括物质传质速率 和催化反应速率的动力学方程；这种方程 一般称为宏观动力学方程。它是设计固定 化酶催化反应器和确定其操作条件的理论 基础。
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4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基 团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物 表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然
后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
聚丙烯酰胺包埋
先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,N-甲叉双丙烯 酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入 聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚 物网络。
特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。 缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
A．重氮法
反应式及原理
B 叠氮法
例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白 酶，步骤如下：
⑴ 酯化
⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
B 叠氮法
对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚
硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联
C．烷基化反应法
含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。
(适用于脲酶、天冬酰胺酶、 过氧化氢酶的固定化) 原因：高聚物网架会对大分 子物质产生扩散阻力导致固 定化酶动力学行为改变，使 活力降低。
查资料自学
溶胶——凝胶包埋法
前驱体（烷氧基硅烷及其衍生物，如TMOS和TEOS）， 在液相下将酶、硅源等均匀混合，经水解、缩合反应，溶 液形成稳定透明的溶胶体系，溶胶进一步陈化，胶粒间缓 慢聚合而形成三维空间网络结构的凝胶，在此过程中凝胶 围绕酶分子而将其包埋，网络间充满了受束缚的溶剂，将 溶剂进行蒸发、超临界等处理后，即获得固定化酶。
尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。
④酶与载体必须结合牢固
能回收贮藏，反复使用。
⑤固定化酶应有最大的稳定性 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
固定化酶的制备原则
⑥固定化酶应容易与产物分离，
即能通过简单的过滤或离心就可回收和重 复使用。
⑦固定化酶成本要低，以利于工业
使用。
利用双功能或多功能试剂
在酶分子间、酶分子与惰 性蛋白间或酶分子与载体 间进行交联反应，把酶蛋 白分子彼此交叉连接起来，
形成网络结构的固定化酶。
目前常用的交联试剂是戊二醛。
戊二醛[OHC-(CH2)3-CHO]有两个醛基，可与 E-NH2生成Shiff’s碱而使酶蛋白间交联，制 成固定化酶，交联时的pH通常与酶的pI相同。
辅基——容易回收
与酶蛋白结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等
物理方法进行回收。
辅酶——回收再生困难
辅酶分子量小，难以截留再生。
将其与水溶性大分子载体或水不溶性载体结合
1.辅基的固定化
过程: 将活化的载体与连接臂连接，再以适当反应与 辅基连接。
功能基团
活 化 载 体 连接臂
辅基
载体的选择
酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少， 酶活力损失很少。
缺点：
酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。
吸附程度的影响因素:
1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附
2. 离子强度：一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓
度增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要 比小分子慢得多。 6. 载体：非多孔性载体---颗粒越小吸附力越强。 多孔性载体--要考虑酶的大小和吸附面积的大小。
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
连接臂的选择
需考虑的因素:
辅基的性质: 疏水性、亲水性、离子性、体积大小 长度: 辅基分子和载体之间需要0.5-1.0 nm 长 的手臂。用较长的疏水烷基作手臀时，由 于亦有吸附强的能力、会使固定化辅基吸 附专一性降低。
(3)有利于工艺自动化和微电脑化
(4)多次使用 (5)较游离酶相比能适应于多酶反应 (6)产品质量高，成本低
固定化酶的制备原则
①必须注意维持酶的催化活性及专一性。
②固定化的载体必须有一定的机械强度
③固定化酶应有最小的空间位阻
有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。
是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶 性载体的方法。
选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面
③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
(1)有机载体： 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。 (2)无机载体： 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二 氧化钛等。 无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。
(2)微囊化包埋法
微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。 胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。 主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
界面沉淀法
物理微囊化法。它是利用某些高聚物在水相和有机 相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此
⑵阳离子交换剂：
羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、 IRC—50、IR—200、 Dowex-50等。 1969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使 用多糖类阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25固定化的。
吸附法特点
优点：
操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过 程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
D．溴化氰法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。 如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为 载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活
化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特
别用作亲和层析，有着良好的性能。
E ．溴化氰法
共价结合法中的影响因素
1. 要求载体亲水，并且有一定的机械强度 和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结 合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、中 等离子强度和低温的缓冲溶液中。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其它功能基团副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
2、离子结合法
(在工业上具广泛的用途)
将酶与含有离子交换基团的水 不溶载体相结合而达到固定化 的一种方法。 在适宜的pH和离子强度条件下， 利用酶的侧链解离基团和离子 交换基团间的相互作用而达到 酶固定化的方法。
离子交换剂的吸附容量一般大于物 理吸附剂。
⑴阴离子交换剂：
二乙基氨基乙基(DEAE)—纤维素、混合胺类(ECTEDLA)纤维素、四乙氨基乙基 (TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝 胶、Amberlite IRA-93、410、900等。
2. 在载体上接上一个双功能试
剂，然后将酶偶联上去。
（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法
A．重氮法
反应示意式如下
A．重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺 酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝 胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
第三章
酶的固定化
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
共价结合法的特点
优点： 固定化酶结合牢固 稳定性好 利于连续使用 是目前应用和报道最 多的一类方法。
缺点:
载体活化的操作复杂， 反应条件激烈，需要严 格控制条件才可以获得 较高活力的固定化酶。 会影响酶的空间构象， 从而影响酶的催化活性, 活力回收率一般较低。
4、化学结合 特性
物理吸附 离子结合
易 弱 高 无变化 可能 低
包埋法
易 强 高 无变化 不可能 中
交联法
难 强 中 有变化 不可能 中
共价结合法
难 强 中 有变化 不可能 高