盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶

疏水层析处理：层析柱尺寸φ2.6 cm×10 cm，平衡 缓 冲 液 为 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4+1.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 6.5)，洗脱缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4 (pH 6.5)，选用 Phenyl Sepharose FF, Octyl Sepharose FF 和 Butyl Sepharose FF 三种疏水介质进行比 较，梯度洗脱，流速为 0.2 mL/(min⋅mL medium).
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过程工程学报
第5卷
UV (mAU) 280
Cond (ms/cm)
3500 3000 2500 2000 1500 1000
(a) Octyl Sepharose FF
120
100
80
60
40
3500 3000 2500 2000 1500 1000
(b) Phenyl Sepharose FF 120 100 80 60 40
疏水层析由于采用水盐系统，避免了使用有机溶 剂，更有利于维持蛋白质的活性[9]. 由于疏水层析需要 在较高盐浓度条件下进行操作，而本实验中经过盐析处
理后的上清液中盐浓度较高，可以直接作为疏水层析进 料，不需要额外的处理步骤. 本研究将盐析技术与疏水 相互作用层析技术(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)相结合进行胰 K 的分离提纯.
传统工艺常采用多步盐析与离子交换层析相结合 的纯化方法，过程繁琐且收率和纯度都不理想. 本实验 结果表明，应用盐析与疏水层析法相结合大规模分离提 纯猪胰 K，时间短、效率高、成本低、工艺稳定且可在 室温下操作，易于实现工业化. 本实验结果与传统工艺 结果的比较见表 2.
2 材料和方法
2.1 实验材料 2.1.1 试剂
激肽释放酶标准品，国家药品检验鉴定中心；胰 K 粗品，苏州天绿制药有限公司提供；层析介质 Butyl Sepharose FF 为 Amersham 公司产品.
硫酸铵、乙醇、NaOH 均为分析纯，北京化学试剂 公司；牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂，上海丽珠 东风生物技术有限公司；苯甲酰−L−精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)，上海伯奥生物科技公司.
medium). 2.2.4 胰 K 纯度及收率计算
采用胰 K 比活及体积计算法.
3 结果
3.1 粗品溶解 采用 2.2.3 所述方法溶解，2 次溶解后，合并滤液，
经取样分析，经过 2 次溶解后，胰 K 全部在上清液中.
3.2 硫酸铵沉淀 通过 35%饱和度的硫酸铵溶液沉淀，可以除去粗品
中的部分杂蛋白；再通过 70%饱和度的硫酸铵溶液沉淀 后，不但可以将胰 K 蛋白全部沉淀，同时可起到浓缩样 品的作用，沉淀经过溶解后可作为疏水层析的样品.
Volume (mL)
Volume (mL)
Volume (mL)
图 2 三种疏水介质上的层析结果 Fig.2 Chromatographic patterns on three hydrophobic media
将收集目标峰进行 SDS−PAGE 分析，如图 3 所示. 可以看到，盐析后经过一步疏水层析提纯，得到比活大 于 500 U/mg 的胰 K 蛋白，电泳银染显示分子量在 28000 左右，符合文献[2]报道. 通过对收集样品的分析，得到 工艺纯化结果，如表 1 所示. 3.4 疏00 1000
(c) Butyl Sepharose FF 120 100 80 60 40
500
20
0
0
0 20 40 60 80 100 120 140
500
0 0
20
0 50 100 150 200
500
0 0
20
2
0 20 40 60 80 100 120 140
介质分离纯化胰 K 的效果. 本实验工艺与传统工艺相比，具有操作简单、快速、回收率和纯化倍数高等优点，有望成
为一种从动物组织中快速分离纯化药用蛋白质的有效技术平台.
关键词：疏水层析；纯化；猪胰激肽释放酶
中图分类号：Q81; TQ02
文献标识码：A
文章编号：1009−606X(2005)05−0550−04
疏水层析放大处理：层析柱尺寸φ7.6 cm×10 cm， 平衡缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4+1.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 6.5)，洗脱缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4 (pH 6.5)，选用 Butyl Sepharose FF 作为疏水层 析 介 质 ， 进 行 梯 度 洗 脱 ， 流 速 为 0.2 mL/(min⋅mL
第 5 卷第 5 期 2005 年 10 月
过程工程学报 The Chinese Journal of Process Engineering
Vol.5 No.5 Oct. 2005
盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶
李冲峰 1，2，王仁伟 1，刘淑珍 1，谭天伟 2，苏志国 1
(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080；2. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
来自胰腺的 K 酶称为胰 K. 胰 K 的提取纯化方法很 多，常见的有硫酸铵沉淀法[3]﹑离子交换层析法[4]﹑有 机溶剂分级[5]、亲和层析法[6]等. 目前，国际上基于胰 K 的纯化研究大多采用阴离子交换(通常为 DEAE 配基)结 合阳离子交换(通常为 CM 配基)，最后加一步凝胶过滤 层析，并且离子交换过程中胰 K 洗脱都采用改变 pH 的 方式. 由于缓冲液的缓冲作用，使柱内 pH 改变缓慢， 周期延长，耗费大量缓冲液，如法国 Bailey 等[7]的纯化 过程，虽然经过三步纯化后胰 K 比活高达 1 254 U/mg， 但收率只有 28.4%；其次离子交换层析与疏水层析结合 或者离子交换层析与亲和层析相结合的纯化方法，步骤 多、纯化周期长且成本也较高，如英国 EI-Thaher 等[8] 的纯化过程，虽然收率达到 87%，但胰 K 比活只有 156.3 U/mg.
考马氏亮蓝 G250，北京欣经科生物技术公司. 2.1.2 仪器
AKTA Purifier 层析系统，Amersham 公司；垂直电 泳仪，Bio-Rad 公司；AllegraTM 21R 高速冷冻离心机， Beckman 公司；紫外可见分光光度计 Ultrospec 2000， 层析柱，Pharmacia Biotech.；普通振荡摇床，中国科学 院武汉科学仪器厂. 2.2 实验方法 2.2.1 蛋白质浓度测定
由图 1 可以看出，不同硫酸铵饱和度的胰 K 蛋白纯 度差异明显. 胰 K 蛋白在饱和度为 10%∼35%的硫酸铵 溶液内没有明显沉淀效果，胰 K 蛋白比活略有升高. 在 硫酸铵溶液饱和度达到 35%时对溶液中的蛋白产生盐 析作用，胰 K 蛋白的析出在 35%饱和度发生. 随着硫酸 铵溶液饱和度的增加，胰 K 蛋白的析出明显增加，至 70%饱和度时，上清液中几乎不含胰 K 蛋白，表明 70% 硫酸铵饱和度即可达到有效沉淀目标蛋白的目的.
第5期
李冲峰等：用盐析与疏水层析相结合快速分离提纯猪胰激肽释放酶
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略经修改，具体方法如下：取 2.0 mL 三乙醇胺缓冲液， 向其中加入 2 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂 200 μL, 3.0×10−3 mol/L 的 BAEE 500 μL，在 25 ℃恒温，获得活 性测定液.
以 253 nm 为紫外吸收测定的波长，将测定液倒入 石英比色皿，作为参比. 取 100 μL 活性为 2 U/mL 的激 肽释放酶标准品加入到测定液中，同时开始计时. 30 s 后开始读数，记录 253 nm 吸光度值. 每 30 s 取 1 次值， 直至延续 16 min 止. 根据吸光度值随时间的变化，做标 准品的酶活动力学曲线.
按 Bradford 蛋白质浓度测定法，用牛血清白蛋白作 标准曲线. 2.2.2 胰 K 活性测定
胰 K 活性测定是在文献[2]的基础上结合文献[10]
收稿日期：2004−10−18，修回日期：2004−12−21 基金项目：国家自然科学重点基金资助项目(编号：20136020) 作者简介：李冲峰(1975−)，男，宁夏隆德县人，硕士研究生，生物化工专业；苏志国，通讯联系人，Tel: 010-62561817, E-mail: zgsu@.
样品的活性测定：将样品稀释至适当浓度，按上述 方法测定其动力学曲线，取曲线斜率，按公式 U=U0K/K0 计算样品的活性，其中 U 和 U0 分别指样品和标准品的 活性(U/mL), K 和 K0 分别指样品和标准品酶活动力学曲 线的斜率. 2.2.3 硫酸铵沉淀
称量胰 K 粗品 30.0 g，溶于 60.0 mL 10%饱和度的 硫酸铵溶液中，搅拌溶解 4 h 后，离心取上清液，离心 力 12000 g；向上清液中缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅 动，使溶液达到 35%的饱和度，常温下静置 2 h 后离心 20 min，离心力 12000 g；弃去沉淀，保留上清液；上 清液中继续缓缓加入硫酸铵粉末并不断搅动，使溶液达 到 70%的饱和度，静置 2 h 后离心 20 min，离心力 12 000 g；去除上清液，将沉淀溶解后进行疏水层析.
1 前言
激肽释放酶(Kallikrein，以下简称 K 酶)属丝氨酸蛋 白酶，广泛存在于血浆、胰、肾、颌下腺及尿中. 药用 K 酶又称血管舒缓素，主要来自颌下腺或胰腺[1].
K 酶能使毛细管和动脉血管舒张及通透性增加，使 冠状血管动脉、脑、视网膜处的血流供应量增加，适用 于高血压冠状血管及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血 管痉挛、肢端感觉异常、闭塞性血栓性脉管炎、冻疮及 创伤等症也有作用[2]. 与同类化学合成药相比，它具有 易为人体吸收、代谢副作用小、长期使用安全的特点.