DL_苯丙氨酸的酶法拆分研究001
酶法拆分技术研究
酶法拆分技术研究作者：刘正威来源：《管理观察》2009年第13期摘要：生物酶法具有转化率及光学纯度高、成本低、反应条件温和、环境污染小等绿色工艺优点，随着生物技术的不断发展，酶法拆分越来越广泛应用于手性药物的制备中。
关键词：酶手性药物拆分法在有机药物合成及天然药物中，有许多具有手性碳或手性中心，因而具有光学异构体。
结构特异性药物是作用于受体、酶、蛋白质、离予通道等作用机制，在结构及电性效应上与这些物质互补，而产生激动或拮抗作用，表现出不同的生理效应。
因此，光学异构体往往在生物活性上具有较大的差异。
但目前临床应用的合成药物约有500多种为外消旋体，而单一对映体的疗效高、副作用低，服用的剂量小，更符合临床应用要求。
近几年手性药的年增长率已经超过20%，2005年全世界上市的新药中约有60%为具有手性的单一对映体药物。
因此，手性药物的开发已非常重要。
手性药物的制备可采用不对称合成方法、生物酶法或经化学合一成方法先制备药物的消旋体，然后再进行拆分而制得。
消旋体药物的拆分有多种方法，传统拆分方法是采用手性拆分剂与不同对映体一形成盐或复合物，根据其在溶剂中的不同溶解性进行分离，或采用物理方法进行诱导析晶分离得到有效的单旋体。
该方法具有拆分效，效率低，光学纯度差，另一单旋体需要消旋化后进行再拆分，操作繁琐，配套设备多、拆分剂及溶剂的消耗量较大，拆分成本较高。
近年来上市的手性药物不断增长，手性药物的制备和拆分技术也有较，大的发展，如液相酶法、固相酶法、不对称转换法、包结法等拆分技术，均较传统的拆分方法拆分效率高，且光学纯度好，拆分成本低，对环境友好。
酶是一种高活性、高特异性和高立体选择性的催化剂，可催化多种化学反应。
由于生物酶有很高的对映体选择性，利用生物酶作催化剂拆分手性药物，具有选择性定向、拆分效率高、光学纯度好的优点，可得到光学纯度很高的单对映体药物，这一方法优越。
酶法拆分有液相酶法和固相酶法两种，液相酶法是经微物发酵产生生物酶，直接利用其酶液进行拆分。
L-苯丙氨酸的生产(课堂PPT)
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
❖ 3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源，但随着 研究的深入，显现出很多弊端，如产生葡萄糖 效应和大量副产物乙酸，都会使细菌生长受到 抑制；而甘油价格低廉，容易获得，以甘油为 碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之，虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸 菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处，但 代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨 大的推动力，随着研究的深入，必然会为整个 苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。
表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物 的酶比活增减倍数
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
苯丙氨酸生物合成途径关 键基因的串联表达：
优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达
pheA:编码分支酸变 位酶和预苯酸合成 酶。简写成A
aroF:编码DHAP合成 酶。简写成F
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮
酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由 ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这 两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合 成量，进而提高DAHP的合成量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是 Phe合成途径中的关键酶之一, 受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得 到解除苯丙氨酸反馈抑制的突 变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型 aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium) 野生型aroG基因为亲本,通过 DNA suffling技术对aroG进行 改组,获得的中,在含 有Phe类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的培养基上筛选转化子,获 得4个解除Phe反馈抑制的克 隆..
L-苯丙氨酸
种子培养
斜面培养：LB培养基 斜面培养：LB培养基 种子培养基：蛋白胨1 氯化钠1 酵母粉0 种子培养基：蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡 萄糖2 萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素) pH=7 抗菌素Km(硫酸卡那霉素) 发酵培养基：Na2HPO4 12H 20g/L; 发酵培养基：Na2HPO4·12H2O20g/L;柠檬酸钠 6g/L; g/L; 谷 氨 酸 钠 0.4g/L; 酪 氨 酸 0.6g/L; 葡 萄 糖 g/L; g/L; 20g/L;Km40mg/L 20g/L;Km40mg/L 补料培养基：CaCL2 补料培养基： CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸 500mg/L;葡 g/L;酪氨酸500mg/L; 萄糖500g/L;MgSO4 萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28% g/L;VB1500mg/L;氨水28% 斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→ 斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→三级 种子培养→ 种子培养→发酵罐
L-苯丙氨酸在国内的生产状况
目前国内有10余家制药厂和试剂厂生产L 目前国内有10余家制药厂和试剂厂生产L- 苯丙氨 酸（见下表），但生产规模普遍偏小，产量极低， 见下表） 但生产规模普遍偏小，产量极低， 产品一般用于本厂生产药品和生化试剂， 产品一般用于本厂生产药品和生化试剂，不能满 足国内市场日益增长的需求。 足国内市场日益增长的需求。
提高Ｌ－苯丙氨酸产量的策略 提高Ｌ－苯丙氨酸产量的策略 Ｌ－
选育L 酪氨酸和L 选育L-酪氨酸和L-色氨酸营养缺陷型突变株 选育L 选育L- 苯丙氨酸 、 L-酪氨酸 ﹑ L-色氨酸抗性突 变株 敲除合成丙酮酸激酶基因来增加PEP的供应 敲除合成丙酮酸激酶基因来增加PEP的供应 扩增大肠杆菌中合成转酮醇酶（ 扩增大肠杆菌中合成转酮醇酶（磷酸戊糖途径中 合成E 的关键酶）的基因来增加E 合成E4P的关键酶）的基因来增加E4P的供应 降低副产物乙酸的生成 筛选抗噬菌体（BP筛选抗噬菌体（BP-1）的突变菌株
植物苯丙氨酸代谢相关酶基因启动子研究进展
植物 启动子 是重要 的顺式 作用元 件 ， 位于结 构基 因 ５ 端上 游 区 的 Ｄ 是 ’ ＮＡ 序 列 ， 能指 导 Ｒ 它 ＮＡ 聚合 酶与模板 的正确 结合 ， 是转 录调控 的中心 。研究苯 丙氨 酸代谢相 关酶基 因 的启 动子 ， 能从分 子机理 分析其
化苯 丙氨酸转 化为 肉桂酸 ， 促进 黄酮 、 豆素 等次生代 谢物 的生成 。Ｐ 香 ＡＬ只 存在 于植 物 和微生 物 中， 够 能 应 答伤 害 、 病原 菌 、 物激素 等多种 胁迫诱 导 。 植 ］
１ ２ 苯 丙氨 酸解氨 酶基 因启 动子研 究 ． （ ） 丙氨 酸解 氨酶基 因启动 子类 型 植物 Ｐ １苯 ＡＬ活性 的调控主要 在转 录水平进 行 ， 且受 到 Ｐ 并 ＡＬ启 动 子 的影 响 。现 已在 豌 豆 （ ｓｍ ａｉｕ ． “ 、 南 芥 （ ａ ｉ ｏ ｓ ）５、 芹 （ ｅｒｓｌ ｕ ｒｓ — Ｐｉ ｕ ｓｔ ｍ Ｌ ） ］ 拟 ｖ Ａｒｂｄ ｐ ｉ ｌ 欧 ｓ ｊ Ｐ ｔｏｅｉ ｍ ｃｉ ｎ ｐ ｕ 【、 ｍ）６ 白杨 木 （ ｏ ｕｕ ｉ ｏａ ｐ × Ｐ。 ｅｔｉｅ ） ３ 扁 豆 （ ｏｉｈ ｓ ａ ｌｂ Ｌ ） ］ 菜 豆 （ ｈ ｓｏｕ ｊ Ｐ ｐ ｌｓ ｒｃ ｃ ｒ ａ ｔ ｈ ｄ ｌ ｄ ｓ［ 、 ｏ ７ Ｄ ｌ ｏ ｂａ ． Ｅ 、 ｃ ｌ ８ Ｐ ａ ｅｌｓ ｖ ｌａ ｉ Ｌ ）９、 稻［ 麻 风树 （ ａｒ ｐ ａＣ Ｆａ ． Ｅ］ ｕｇ ｒｓ ． Ｌ 水 ］ １ 、 Ｊ ｔｏ ｈ Ｃ ＳＬ ）ｎ 等植物 中获得 苯丙氨 酸解氨 酶基 因的启动 子 ； Ｕ 通 过 ５ 端侧翼 区缺失实 验 ， 现启 动子 一些 特定 区域 和保 守 元件 对 Ｐ ’ 发 ＡＬ的 表达 水 平有 重 要 作用 。分 为 ４
DL-苯丙氨酸的合成和拆分
浙江人学坝Ｉ‘学位论殳
课题就是在这一背景下开展的。 单一手性化合物的获得方法有三种：１）手性源合成法：以手性物质为原料合
成其他手性化合物。这种方法是有机化学家最常用的方法。但是由于天然手性物 质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大困难，而且步骤繁多的合 成路线也使得最终产物成本十分高昂。２）不对称合成法：是在催化剂或酶的作 用下合成得到单一对映体化合物的方法。化学不对称合成和生物不对称合成近 ２０年来取得了长足进展，并且已丌始进入工业化生产。但是化学不对称合成高 旋光收率（如ｅｅ９０％以上）的反应仍然有限，所得产物的旋光纯度对于大多数实际 应用来说仍不够高。生物不对称合成具有很高的对映选择性，反应介质通常为缓 冲水溶液，反应条件温和，但对底物的要求高，反应慢，产物分离因难，因而在 应用上也受到…定的限制。３）＃ｂＮ旋体拆分法：是在手性助剂的作用下，将外消 旋体拆分为纯对映体，这种方法已被广‘泛使用。掘统计，大约有６５％的非天然 手性药物是由外消旋体或中Ｉｔ日Ｊ产物的拆分得到的【３】。
ＣＨ２ＣＨＣＯＯＨ
Ｉ
ＮＨ２
英文名：ｐｈｅｎｙｌａｎｉｎｅ，缩写为Ｐｈｅ 分子式：ＣｇＨｌｌＮ０２ 分子量：１６５ １９
苯丙氨酸为无色至白色片状晶体或结晶性粉末。有特殊气味和苦味。约在 ２７１—２７３℃熔化并分解。Ｌ－苯丙氨酸和Ｄ－苯丙氨酸的熔点为２８３—２８４℃（分解）。 １０％水溶液的ｐＨ值为５．４－６．０。在受热、光照、空气中稳定。与葡萄糖一起加热 则着色。碱性下不稳定。溶于水（３９／１００ｍｌ，２５＂Ｃ）。难溶于乙醇、稀无机酸和 碱性溶液。Ｌ－苯丙氨酸的旋光度为－３５。（Ｃ＝２，水），Ｄ一苯丙氨酸的旋光度为
ａｃｔｉｖｅ ｓａｌｔ ｗｉｔｈ Ｌ（＋）·ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｅｔｈａｎ０１．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ
苯丙氨酸衍生物分子印迹聚合物的制备及手性拆分研究
性物质的化学及物理性质的极其相似， 决定其检测 和分离是化 学 工 作研 究 者 的难 题 。手 性 技 术 工 业 通 常采用 生物 酶拆 分 、 化学 拆 分 等方法 ，但 步骤 复 杂， 且适用 范围窄。近几年来， 分子 印迹技术为手 性 分子 的分离 提供 了一条 新颖 且有 效的途 径 ， 已 并 在 分离提纯 、 疫 分 析 等 领域 ， 示 出广 泛 的应 用 免 显 前景ｌ 。采用分子 印迹技术合成制备手性色谱 ｌ “Ｊ 固定相 ，因为 其 特 异选 择 性 和 产业 化 后 的 价 格低 廉等优点 ， 成为手性物质拆分研究 的热点。 分子印迹技术是 以待分离 、 检测的物质为模板 分子 ， 预定性地制备对其具有高度选择性的功能性 高分 子材料 。其 制 作 步骤 为 ： １以待 拆 分 的单 一 （） 对映体或其 它难分离 、 检测的分子为模 板， 与可聚 合的功能性单体 以共价键 或非共价键形成稳定的 配合物 ；２ 加入交联剂及引发剂 ， （） 合成刚性且 交联度高的聚合物 ；３ 用恰 当的溶剂洗脱除去高 （） 聚物 中的模 板分 子 ， 物 中留 下 了与模 板 分子空 聚合
作者简介 ： 李
一
萍 （９４一） 女 ， １７ ． 研究生
ｌ 一 ２
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第 ２ 卷第 ２期 １ ２０ 年 ３月 ０２
Ｃ ｉ Ｊｕ分ｌ ｆＡ ａｙ ｈｒ Ｉ ｏ ｒａ 试验 ｌｓ ｎ 析 ｎ 室 ０
．１ ｏ２ ２ Ｎ ．
２０ ０ ２—３
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第 ｆ２ ３月 ２ １ ２０卷第 ２期 ｉ 年
分析试验室
Ｃ ｉｅｅＪ ｎ ｌ ｆ ａ￣ ｈｎｓ ￣ ａ ｌ ｏ Ａｎ
ｖ０ ． １ Ｎ １２ ． ０ ２ ２０ ～３ ｉ ｆ２
苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法）说明书
苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法）说明书【产品名称】通用名称：英文名称：【包装规格】【预期用途】【检验原理】【主要组成成分】【储存条件及有效期】【适用机型】【样本要求】【检验方法】【参考值（参考范围）】【检验结果的解释】【检验方法的局限性】【产品性能指标】【注意事项】【参考文献】【生产企业】【医疗器械生产企业许可证编号】【医疗器械注册证书编号】【产品标准编号】【说明书批准及修改日期】【产品名称】通用名：苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法） 英文名称：Phenylalanine Kit （Enzyme ）【包装规格】96人份/盒 480人份/盒【预期用途】用于定量检测采集在S&S903# 滤纸上的新生儿全血样品中苯丙氨酸的浓度。
本试剂盒适用于新生儿苯丙酮尿症（PKU ）的筛查检测。
仅用于体外检测。
苯丙酮尿症（简称PKU ）是一种较常见的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，发病率约1/10,000。
本病可因苯丙氨酸羟化酶缺乏引起，也可因辅酶因子BH 4缺陷引起。
这些缺陷致使苯丙氨酸不能被转化为酪氨酸，导致大量的苯丙氨酸及其代谢产物在体内堆积，引起中枢神经系统损害。
其临床主要表现为：发育迟缓，毛发、皮肤及虹膜变浅，癫痫，进行性智力低下等。
由于本病的早期发现早期治疗，对患儿的生长发育、智力发育不受影响，因此被我国列为新生儿疾病筛查项目之一。
检测方法还有细菌抑制法、荧光法等。
【检验原理】采用三氯醋酸（TCA）从干血片中萃取苯丙氨酸。
苯丙氨酸被苯丙氨酸脱氢酶转化成苯丙酮酸 。
这个反应伴随着反应混合物中存在的辅酶NAD+减少，生成NADH，这个氧化还原反应中把添加的四唑盐转化成橙黄色物质Formazane。
Formazane 的量与样本中苯丙氨酸的量成正比。
使用酶标仪检测其光密度值，即可换算成其对应的苯丙氨酸浓度值，酶标仪波长使用450nm。
【主要组成成分】名称96人份/盒 480人份/盒 包装酶稀释液（Triton X-100缓冲液） 11ml /瓶 55ml /瓶无色透明玻璃瓶或棕色玻璃瓶底物（四唑盐）11ml /瓶 55ml /瓶 中和液（碳酸盐缓冲液） 5.5ml /瓶 27.5m l/瓶 三氯醋酸溶液（3%） 17ml /瓶 85 m l/瓶 酶（冻干粉） 1瓶（冻干粉） 5瓶（冻干粉） 辅酶（冻干粉） 1瓶（冻干粉）5瓶（冻干粉）96孔微孔板2块 10块 铝箔袋 标准血片S1～S5 1.1、2.8、5.3、9.6、17.3mg/dl 1份 2份 无色透明塑料袋质控血片C1：2.2– 4.2 mg/dl C2：4.6– 8.6 mg/dl 1份2份说明书 1份 质量验证单1份注：标准品或质控品的浓度若有改变，将在试剂盒内放通知单，同时电话通知。
氨基酰化酶的固定化和苯丙氨酸消旋体的拆分
氨基酰化酶的固定化和苯丙氨酸消旋体的拆分
酰胺氨基酰化酶(Aminoacylase, AACase)，又称酰胺氨基脱水酶，是一
种有用的酶，用于离子交换层析（IEC），表面活性剂制备和药物改性
等方面。
AACase可用于酰胺肽、抗生素和非抗生素多种氨基酸的脱氢
和脱水，以及其他有机物的羧基氨基酰化作用，主要应用于制药工业。
一、酰胺氨基酰化酶的固定化：
1、依托微球的氨基酰化方法：小的硅酸盐粒子，具有良好的化学稳定性，可以通过酰胺氰基化术固定AACase。
2、电化学固定化：将AACase电沉积到不锈钢或其他金属电极上，从
而实现AACase稳定固定化，而不会降解或失活。
3、adsorption-free固定化技术：在这种技术中，AACase被定向活化，
然后通过Ca2＋极性结合固定框架，实现AACase固定化。
二、苯丙氨酸消旋体的拆分：
AACase还可以用于拆分对映化苯丙氨酸(L-Phenylalanine)消旋体。
传
统方法可实现100％的拆分消旋体，由于AACase的作用，消旋效率可
提高到98％，大大降低了投资和生产成本。
综上所述，酰胺氨基酰化酶是一种有效的酶，可用于制定各种有机及
非有机物质的酰胺氨基酰化，苯丙氨酸消旋体等，这些反应需要稳定、有效的固定化。
通过依托微球的氨基酰化、电沉积、活性定向固定三
种方法可以有效地实现AACase的固定化，有效拆分苯丙氨酸消旋体，使得酰胺氨基酰化反应效率更高，经济性更好。
酶法水解L-苯丙氨酸菌体蛋白工艺探讨
０８ ． ０ ０８ ． ０
１２ ＿ ３
６． ５１ ６． ６３
６． ６４
２９ ． ２ ２３ ． ８
３ ３ ． ９
从 表 １可知 ， 碱性 蛋 白酶在 酸性 条件 下 ， 去 酶活 失
２３ 碱性蛋 白酶对调碱性 后的菌体蛋 白水解作用 ． 菌 体 蛋 白调 ｐ 至碱 性 后 ，碱 性蛋 白酶样 品 Ｈ 加 入菌 体蛋 白并 烘 干 ， 结果见 表 ２ 其 ：
力， 以致 于没 有作用 效果 ， 而酸性 蛋 白酶作 用 菌体
蛋 白 ， 氮含 量则提 高 了 ６ ％－ ０ 氨 ０ ７ ％。
表 ２ 碱 性蛋 白酶 对调 ｐ Ｈ后 的菌体 蛋 白作 用效 果
项目
麸 皮
碱性 酶样 品
ｐ Ｈ
６５ ．５
６７ ．９
氨 氮 含 量 ｍ 培（ ） ｇ 湿
ｐＨ 。
氏定 氮装 置 ，Ｈ１ Ａ水 分 测 定 仪 ， Ｊ ０ ０可 见 Ｓ ０ ＷＦ ２ ０
分 光 光 度 计 ，Ｄ ４ ＷＳ低 速 自动 平 衡 离 心 机 ， Ｔ Ｚ一 Ｄ 一 Ｄ 电热 恒 温水 槽 ，Ｋ 一 １ Ｃ恒 温 培养 振 荡 Ｋ８ Ｓ Ｙ ２１
１ ． 碱性 蛋 白酶对调 碱性 后 的菌体蛋 白作 用 ．３ ４ 以 ５ ｕｍ 碱性 蛋 白酶 液 与麸 皮 １ １吸 附后 ０ ／ｌ ： 为碱性 蛋 白酶样 品 ，再取 １ ｇ 性蛋 白酶样 品加 ０碱 入 ５ ｇ 体 蛋 白 ， 拌 均匀 ， ４ ℃烘 干 即可 ， ０菌 搅 于 ０ 测 定 其氨 氮含量 、 水量及 ｐ 含 Ｈ。 １ ． 酶加入 量对 菌体 蛋 白水 解影 响 ．４ ４ 湿 菌 体 蛋 白按 不 同 比例 直 接 加 入 酸 性 蛋 白
海因消旋酶用于制备D-苯丙氨酸的工艺研究
作者简介：王胜锋（1983-）,男，湖南新邵人，工程师，主要从事酶学,
生物催化相关工作。
• 164 •
121海因转化制备N・氨甲酰苯丙氨酸 称取3O.OgL-5-节基海因投入反应罐内，加入一定量的碳
酸钠和水，定容至600mL,调pH 9.0,海因溶解。配料完成。 将一定的固定化酶加入反应罐中，开启反应，反应过程中控
第45卷第7期
201h and Development
化工设计通讯
Chemical Engineering Design Communications
海因消旋酶用于制备D-苯丙氨酸的工艺研究 in#,黃 数，漆殊艳，曾紅字，许 岗
(湖南宝利士生物技术有限公司，湖南长沙410331 )
Wang Sheng-feng, Huang Yi, Liao Fen-yan, Zeng Hong-yu, Xu Gang
Abstract : The synthesis process of D-phenylalanine by enzymatic method was studied.On the basis of the original benzyl hydantoin hydrolysis process, the input of hydanotrophase was increased.Under the same conversion rate, the reaction temperature could be decreased by 25 degree.The optimal reaction temperature of the hydanozyme was determined by optimizing the process conditions.By contrast, increasing the hyalin racemase can greatly reduce the transformation temperature, contribute to the stability of the enzyme activity of the hydantoin, and also reduce the energy consumption of production.The method is environmentally friendly, has little environmental pollution, and is suitable for industrial production.
《合成化学》2007年(第15卷)总目次
２氨基－ ，－ － ６ ７二甲氧基－ 喹啉－－ ３ 甲酸 甲酯 的合成 ………………………………………… 陈杏芬 用 Ｎ Ｂ 还原 ３ （ ，－ 氧基苯基 ）２羟基丙烯酸 甲酯… ……………… 童元峰 ａＨ －３４ 二苄 －－
４ ， （”－二－１３ 二氧 ［ ，－］ ”５）｛ ［ ，］ ４ ４５ 喹啉 ｝ ｇ － 二苯并 ． ． ６ １ 冠－ 的合成 ………… 黄泽鑫 ８ 六 甲氧基联苯手 性双膦配体的合成方法改进 …………………… 王丽萍 冯文化 苯炔前 体邻－ 甲硅基苯 酚三氟 甲磺酸酯 的合成 …………………………… 仵清春 三
三嗪基 三取代氨基 甲酰脲 的合成及其生物活性
…… ………… ……… …………… …………… 朱丽学
朱兆富（ — ６ １ ４）
范华芳 （ —５ ） １ ０
７羟基黄酮醇和 ７羟基 黄烷 酮及其衍生物 的合成 ……………… …… ………………… 汪秋安 ． － 巴 比妥酸的质子迁移异构化 反应及其芳香性 的密度泛 函研究 高固体分羟基丙烯酸树脂 的合成
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合 成 化 学 Ｃ ｉｅｅＪｕ ａ ｏ ｙｔｅｃＣ ｅ ｉ ｒ ｈｎｓ ｏｒ ｌ ｆ ｎ ｔ ｈｍ ｓｙ ｎ Ｓ ｈｉ ｔ
《 合成化 学》 ２ ０ ０７年（ ｌ 第 ５卷 ）
总 目
第１ 期
次
果糖衍生手性酮催化烯烃不 对称环氧化反应 的研究进展 ……………………………… 肖 坤 钯催化 ． 酮酸酯脱羧制备 ，－ 卢 不饱和 酮的方法介绍 ………………………… 陈海锋 二茂铁 咪唑盐的合成及其在 Ｓ ｚｋ —Ｍ ｙｕａ ｕｕ ｉ ｉａｒ 反应 中的应 用 …… 张 宏 童 庆松 杨 贾 琳 莉
陈庆华 （ — ０ １ ２） 佟 健 （ — ６ １ ２）
D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸
氨基 酸和生物资源 ２ ０ ， （ ） ３ ３ ０８３ １ ： ０ ６— ８
Ａｍ／ ｏ Ａ ｉ＊ ＆ Ｂｉｔ ｓ ｕ ｃｓ ｎ ｃｄ ｏ ｉ Ｒｅｏ ｒ ｅ ｃ
Ｄ一氨基酰化酶拆 分 Ｄ， 苯丙氨 酸制备 Ｄ一 Ｌ一 苯丙氨 酸
闫 博 ， 占锋 朱
Ｄ ＷＳ一 １钠度计 、Ｈ ５ Ｐ Ｓ一３ Ｂ酸 度计 、 Ｓ一 Ａ熔 点 ＷＲ ２
仪 均为 上海精 密科 学仪 器有 限公 司产 品 。
１ ２ 乙酰 一Ｄ． ． Ｌ一苯 丙氨 酸 的 制 备
逐渐增 多 。Ｄ一 基酸 酰化 酶 可 以直 接水 解 乙酰 一 氨 Ｄ一 氨基 酸 而得到 Ｄ一氨 基 酸 ， 水 解 的 乙酰 一Ｌ一 未
件 温和 ， 境友 好 、 环 能耗 低 ， 收率 高等 优点 ， 制备 Ｄ 是
一
这种 方法 工 艺 简 单 、 率 较 高 、 品 光 学 纯 度 收 产 高， 具有 很好 的发 展 前 景 。本 文进 行 了 以 Ｄ， Ｌ一苯 丙氨 酸 为原料 经 Ｄ一氨基 酰化酶 制备 Ｄ一苯丙 氨 酸
定 时取 样 ， 品迅 速煮 沸灭 酶活 ， 样 用纸 层析 法检 测 Ｄ
一
苯丙 氨酸 的含 量 。
叫 Ｎ—Ａ ｙ —Ｄ—ａ ｉｏａｉ ｍ ｄ ｈｄｏ ｓ 的研 究 ｃｌ ｍ ｎ ｃ ａ ｉｏ ｙ ｒ ａｅ） ｄ ｌ
８ ） 自 日本 天野 酶制 品株式 会社 ， 乙酰 一Ｄ， １购 以 Ｌ一
苯 丙氨 酸为 底物 时 的酶 活 为 １０×１ Ｕ ・ ‘。Ｄ， ． ０ ｇ。
Ｌ一苯丙 氨 酸购 自安 徽 恒 锐 新 科 技 有 限公 司 ， ０ １ Ｄ ６ 强 酸性 阳离 子交换 树 脂购 自天津 市 和成科技 有 限公 司， 其它 试剂 均 为市售 分析 纯试 剂 。 ＷＺ Ｚ一２ 自动 指示 旋 光仪 、２ Ｎ分 光光 度 计 、 Ｂ ７２
苯丙氨酸的生产工艺研究
河北科技大学硕士学位论文苯丙氨酸的生产工艺研究姓名：张朝晖申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：刘守信20100501摘要摘要目前，国内外苯丙氨酸的生产方法主要有生物法和化学法。
其中生物法的缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格并且这种方法只适合于合成天然的L-苯丙氨酸。
化学法则存在污染严重，路线长，拆分困难等问题。
D-苯丙氨酸的生产主要是作为制备L-苯丙氨酸的副产物，目前也有报道发酵法生产D-苯丙氨酸的文章出现，但未见规模生产。
鉴于此，我们根据多年的研究提出了一条新的苯丙氨酸生产工艺路线，首先以丙二酸二乙酯和氯化苄为原料，在碱性条件下合成苄基丙二酸二乙酯，再以亚硝酸酯为肟化剂，乙醇钠为碱，对苄基丙二酸二乙酯进行肟化，得到α-苯丙酮肟酸酯。
最后对α-苯丙酮肟酸乙酯进行了还原，得到DL-苯丙氨酸或其衍生物。
产品再经生物拆分即可得到单一构型的苯丙氨酸。
在第一步反应中，我们用超细微复合碳酸盐代替传统的醇钠，进行反应，从而解决了传统方法易生成二取代物及对设备腐蚀严重的问题，并且工艺过程大为简单，收率可达83%以上。
在第二步反应中，肟化和羧酯的脱去一步完成，减少了反应步骤，提高了收率，此外我们通过工艺研究，解决了亚硝酸酯难易工业化的问题，得到了较好的工艺条件，反应温度为0℃，反应时间为9小时，在20升的放大实验中，收率稳定在90%以上。
在最后的还原步骤中，我们首次采用非晶态镍作为催化剂，硼氢化钠为还原剂，催化还原了碳氮双键，得到了混旋的苯丙氨酸，收率在85%以上，并对非晶态镍的催化机理进行了初步的研究。
另外，我们研究了锌/醋酸体系和催化加氢对α-苯丙酮肟酸乙酯的还原方法，收率均可达90%以上。
关键词苯丙氨酸；肟化；硼氢化钠；非晶态镍；催化加氢I河北科技大学硕士学位论文AbstractAt present, there are two major methods to produce L-phenylalanine, one is the biotransformation and the other is chemical method. The former has some disadvantages, such as a lower concentration of the fermentation product, a long time in a cycle-period of product, and more strict requirements for process control; what’s more, this method is only suitable for the sysnthsis of natural L-phenylalanine. As for the chemical method, its disadvantages including serious pollutions, long route and tedious procedure of chemical resolution.The D-phenylalanine is mainly as a by-product of producing L-phenylalanine. Although there are some reports about producing D-phenylalanine by fermentation method, it is no large scale.Here, a new procedure to produce Phenylalanine was developed in large scale. First, diethyl malonate and benzyl chloride as starting materials were used to produce diethyl benzyl malonate under basic condition. Then it reacted with ethyl nitrited to give α-benzene pyruvic acid oximide ethyl in the presence of sodium ethylate. At last, the production above was reduced to give DL-phenylalanine or derivatives of DL-phenylalanine. The optical purity compound L- and D-phenylalanein is obtained by biocatalysts resolution.In the first step, superfine compound carbonate was instead of sodium ethoxide which was used in traditional method. By this way, the problems caused by sodium ethoxide could be solved, such as di-replacement, serious corrosion to the apparatus and danger. More important , a far more simple procedure was got,meanwhile the yield was over 83%. In the second step, the oximation and the leaving of carboxylester were completed in one step that, shorted the procedures and improved yields. In addition, a large scale produced was realized and a better condition was got by optimized the reaction conditions,that the reaction tempreture was 0℃, reacted for 9 hours. The yields were up to 90% in a 20L reactor. At last, the oximes above was reduced by NaBH4/amorphous Ni to give DL-phenylalanine, yield up to 85% and studied the catalysis mechanism of amorphous Ni. What’ more, ethyl N-acetyl-3- phenylalanine（ethyl phenylalanine）was got by reducing α-benzene pyruvic acid oximide ethyl reduced with Zn/acetic acid system or catalytic hydrogenation, and the yields were up to 90%.Key Words phenylalanine；oxime；sodium borohydride；amorphous nickel；catalytic hydrogenationII第1章绪论第1章绪论1.1 引言氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。
几种氨基酸的拆分研究
几种氨基酸的拆分研究作者：王玉婷蒋立建来源：《硅谷》2008年第14期[摘要]以交联聚苯乙烯为原料树脂，二苯甲酰酒石酸酐为傅克酰基化反应的酰化试剂合成手性树脂拆分剂，用制备的手性树脂初步进行了DL-氨基酸的分离研究，该树脂拆分剂对几种氨基酸有明显的拆分作用。
[关键词]聚苯乙烯酰化反应手性拆分剂氨基酸中图分类号：O69 文献标识码：A 文章编号：1671－7597(2008)0720001－01一、氨基酸的应用氨基酸是构成生命物质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。
随着生物工程技术产业的发展逐渐成为21世纪全球的主要产业之一，氨基酸的特殊性质，决定了其在食品、医药、添加剂及化妆品行业的广泛应用。
目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，从组成上看，中国自20世纪60年代起，食品工业的氨基酸用量占61%，饮料工业的氨基酸用量占30%，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。
随着人们对手性氨基酸的深入研究, 组成人体内生命物质的20种基本氨基酸除甘氨酸外,都有两种互成镜象的对映体D型和L型, D型和L型异构体在生物体中的活性差异很大,对这一问题的探讨,有助于了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础。
因此D、L-氨基酸的分离方法一直是一项热门课题二、氨基酸的拆分进展广泛应用于手性化合物拆分和分析的各种手性柱固定相的制备研究一直是手性化合物研究热点之一[1,2]，与此相关的手性修饰和不对称树脂合成研究在手性固定相研究中占有重要地位[3]。
聚苯乙烯与其它聚合物相比，具有成本低、应用范围广，其原料价格便宜、在市场上很容易购得，且单体经控制一定条件聚合后，可以获得各种大小、性能优异、形状规整的微球。
另外聚合物链上的苯环可以通过芳环的亲电取代反应引入各种所需要的功能基团。
以二乙烯基苯交联的大孔或凝胶型聚苯乙烯树脂不溶于水、酸、碱和有机溶剂，有较好的抗氧化性、稳定性好、易于功能基化，广泛应用于制备各种离子交换树脂。
生物制药工艺学 思考题
第一章。
1、简述生物制药工艺学的性质和任务生物制药工艺学是一门从事各种生物药物的研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。
具体任务:①生物药物的来源及其原料药物生产的主要途径和工艺过程；②生物药物的一般提取、分离、纯化、制造原理和生产方法；③各类生物药物的结构、性质、用途及其工艺和质量控制.2、重点研究方向利用基因工程开发生物药物已经成为一个重要的发展方向，已经上市的有人胰岛素（1982）、人生长素（1987）、干扰素（1987）、乙肝疫苗（1987）等等。
3、生物药物的特性和分类性质:(1)在化学构成上，生物药物十分接近于体内的正常生理物质, 进入体内后也更易为机体所吸收利用和参与人体的正常代谢与调节。
(2)在药理学上, 生物药物具有更高的生化机制合理性和特异治疗有效性。
(3)在医疗上，生物药物具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小、疗效可靠及营养价值高等特点。
(4)生物药物的有效成分在生物材料中浓度都很低, 杂质的含量相对比较高。
(5)生物药物常常是一些生物大分子。
它们不仅分子量大, 组成、结构复杂, 而且具有严格空间构象, 以维持其特定的生理功能。
(6)生物药物对热、酸、碱、重金属及pH变化都较敏感，各种理化因素的变化易对生物活性发生影响。
分类:天然生物药物: 氨基酸类药物、多肽和蛋白质类药物、酶与辅酶类药物、核酸类药物、多糖类药物、脂类药物、细胞生长因子与组织制剂、微生物药物(抗生素类)、海洋生物药物（多糖类、聚醚类、大环类脂类、萜类、多肽和蛋白质类）基因工程药物:细胞因子干扰素类、细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子、造血系统生长因子类、生长因子类、重组多肽与蛋白质类激素、心血管病治疗剂与酶制剂、重组疫苗与单抗制品基因药物医学生物制品：包括各种疫苗、抗血清(免疫血清)、抗毒素、类毒素、免疫制剂(如胸腺肽、免疫核酸等)、诊断试剂等。
4、简述生物药物的研究发展趋势●利用基因组学的研究成果促进生物技术新药的研发●蛋白质工程药物的开发●新型疫苗的研制●新的高效表达系统的研究与应用●生物技术药物新剂型研究迅速发展●生物资源的综合利用与扩大开发●应用现代科学技术，改造传统的抗生素和氨基酸等生产工艺中西结合创制新型生物药物。
酶法拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸
２０ ０７年第 １ ５卷 第 １ ， ９～ ２ 期 ６ ７
合 成 化 学
Ｃ ｉｅｅＪ ｕｎ ｌｏ ｙ ｔｅｉ ｈ ｍｉ ｒ ｈｎ ｓ ｏ ｒａ ｆ ｎｈ ｔ Ｃ ｅ ｓ ｙ Ｓ ｃ ｔ
Ｖｏ ． ５ ，２ ０７ １１ ０
Ｎｏ １．６ ． ９～７ ２
・
研 究简报 ・
酶 法拆 分 Ｄ，一 丙 氨酸 制 备 Ｄ 苯 丙 氨 酸 Ｌ苯 一
黄冠 华 ，夏仕 文
（ ．中国科学 院 成都有机化学研究所 ， １ 四川 成都 ６０ ４ ； ．中国科学院 研究生 院 ， １０ １ ２ 北京 １０ ３ ） ００ ９
摘要 ： 固定化青霉 素酰化酶 （Ｐ ． ０ 存在下 ， 在 Ｉ Ａ７ ） ５ 通过 Ⅳ－ 乙酰－ Ｌ苯丙氨酸 （ ） 苯 Ｄ，－ ２ 的选择性水解完成 了酶法拆 分 Ｄ，． Ｌ苯丙氨 酸（ ） １ 制备 Ｄ 苯 丙 氨酸 （ ） ． ５ 的过程 。选 择性 水解 的较 适 宜反 应条 件 为 ： ．３ ｇ ２２ ８ ，ｍ（ ）： ２ ｍ
病） 抑制剂 的关键 中间体等。由于 ５是非天然氨 基酸， 前 尚无法通过发酵法生产 ， 目 主要通过拆分
ａ ｙ ａ ｅ；ｅ ｚ ｍｅ ｒ ｓ ｌ ｔｏ ｃ ｌｓ ｎ ｙ ｅｏｕ ｎ ｉ
ห้องสมุดไป่ตู้
Ｌ苯丙氨酸 （ ）ｌ ． ３ Ｅ 又称 ． ｉ 氨基 ． 苯丙氨酸 ， 是人和动物必需的氨基酸。生物体 内不能 自身合 成 ３ 必须从外界摄取。Ｄ 苯丙氨酸（ ） ， ． ５ 能增强人
（ 格 列 那 ） 生 产 原 料 ， ＨＶ 蛋 白酶 （ 滋 钠 的 作 Ｉ 艾
（ Ａ７０ ＝ １ ｐ ． ， ３ Ｉ － ） ６： ， Ｈ７０ 于 ０℃反 应 ５ｈ产物为 Ⅳ苯 乙酰．－ Ｐ ５ ， ． Ｄ苯丙氨 酸（ ） Ｌ苯丙 氨酸（ ， ４和 － ３ 收率 ６ ％ ， ３ 光
L-苯丙氨酸生产与应用
发 酵 培 养 基 中各 物 质 的 含 量 对 提 取 过 程 非 常 有 利 。 对发 酵液 进行处 理后 ， 丙氨 酸 的提取率 上 在 苯
升 １％。 由苯 丙 酮酸 生 产 Ｌ 苯 丙 氨 酸 的生 产 工 ２ 一
成苯 丙酮 酸（Ｐ １最 后苯 丙酮 酸经 转 氨作 用生 成 ＰＹ ．
种反 应副 产物 一 硼酸 。此 法适 合工业 上采 用 ， 反
５ ￣ ４４ 。 Ｏ ￣ １ ｇ 旋 光 度一 ３ ． ２ ￣） 苯 丙 １Ｃ：． Ｉ ０Ｃ：０ 。 ｇ ４５ ５Ｃ 。 （ 氨酸有 外消 旋 Ｄ 一 ， 和 Ｄ型 。 中最 重要 的 Ｌ 型 Ｌ型 其
是 Ｌ 苯 丙氨酸 。酸 （ ｙ ｒｓ一 一 ｈ ｓｈ ｔ。Ａ ） ４磷 ｅ ｔ ｏｅ ４ ｐ ｏｐ ａｅ Ｆ Ｐ ￣糖 酵 ｒｈ
解 过 程 的 中 间 产 物 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 （ｈ ｐ ｏｎ ｌｙｕ ａｅＰ Ｐ二 者 缩合 形成 一个 七碳 ｐ ｏｈ ｅ ｏｐ ｒｖ ｔ，Ｅ ） 酮 糖开链 磷 酸化合 物称 为 ３ 脱氧 一ｔ阿拉伯 庚酮 一 Ｏ 一
一
１ 理 化 性 质
Ｌ 苯 丙氨 酸 ｆ— ｈ ｎ ｌ ａ ｉｅ 简称 Ｌ Ｐ ｅ又 一 Ｌ Ｐ ｅ ｙａ ｎｎ ， ｌ — ｈ）
名 Ｌ 苯基 一 氨基 丙 酸 ， 白色 斜方 晶系 结 晶粉 一 一 为
步法合 成 氨基酸 的技 术是 一项 既有效 又不
污染 环境 的合 成胺 和氨 基酸 的方法 。此 法可 同时 将氨 基酸 的三 个成 分 即氨基 、羧 基和侧 链结合 在
作 医药 的化 合物 。
一
步法 合成 氨基 酸 的反 应是 从 以往 各种 合成
法 的研究 中开发 出来 的 ，它 是一种 采用 过渡 金属
D,L-苯丙氨酸对映体拆分的研究进展
D,L-苯丙氨酸对映体拆分的研究进展M140101006 高金伟摘要：氨基酸是组成蛋白质的基本单元，在人体及动物生命活动中起着举足轻重的作用。
不同旋光异构性的氨基酸在动物体内代谢途径不同，发挥着不同的生理作用和生物活性。
对近年来采用手性试剂拆分法、色谱拆分法、电泳拆分法、膜拆分法、酶促拆分法、萃取法等分离方法拆分D,L-苯丙氨酸对映异构体的研究进展进行了简要的概述。
关键词：D,L-苯丙氨酸；对映异构体；拆分手性是指原子组成相同，在立体结构上互为镜像，可以比喻为人的左手和右手。
互为镜像关系而不能重合的一对分子称对映异构体(对映体)。
对映异构体都有旋光性(其中一个是左旋体，另一个是右旋体)，又称旋光异构体(光学异构体)。
一对对映异构体右旋体和左旋体的等量混合物称外消旋体。
对映异构体在药物中占很大比例，常用药物中40%为外消旋体，天然药物中98%为旋光异构体[1,2]。
虽然对映异构体物化性质基本相同，但由于药物所作用的受体或靶位是蛋白质和核酸等手性大分子，对与其结合的药物分子空间构型有特殊要求，因此对映异构体药物在体内往往呈现很大药理、毒理作用及药效学、药动学方面的差异[3]。
典型的例子是“Thalidomide(沙利度胺)事件”，研究表明其R-Thalidomide具有治疗呕吐的作用，而S-Thalidomide却具有很强的致畸作用。
该外消旋药物在20世纪60年代的广泛使用，使数千名婴儿致畸，成为上世纪医疗界的悲剧[4]。
鉴于此，在制药工业，许多国家规定必须对药物的对映体限度进行控制。
美国食品与药品监督管理局(FDA)1992年颁布了手性药物指导原则，要求新型手性药物在上市前必须对其对映体分别进行药效研究，说明对映体各自的生理活性、药理作用、毒性和临床效果，如果其对映体药理、毒理等数据表明该对映体不具有治疗作用，则该对映体的含量应进行严格控制。
因此，对映体拆分和控制在药物合成及质量控制中已成为一个不可回避的问题。
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第 20 卷第 1 期 化学反应工程与工艺V o l 20, N o 12004 年 3 月Chem ical R eactio n Eng ineering and T echnolo gyM ar, 2004文章编号: 1001- 7631(2004)01- 0064- 06D L-苯丙氨酸的酶法拆分研究 何仕国 俞一军 许文松(浙江大学化学工程与生物工程系, 浙江 杭州 310027)摘要: 利用氨基酰化酶能立体专一地水解氨基酰化物的特点, 选择性地水解N -乙酰-L -苯丙氨酸得到 L -苯丙氨酸, 经分离后再水解N -乙酰-D-苯丙氨酸得到 D-苯丙氨酸。
研究中分别考察了 pH 值、温度、酶用量、底mol LpHw (酶)/w (底物)= 1∶41. 4, 加入浓度为 1×10- 3mol/L 的C o 2+ , 将 N -乙酰-D-苯丙氨酸用有机溶剂结晶和盐酸水解 10 h) 得到光学纯度 OP = 98. 8%的 L -苯丙氨酸, 收率 70. 3%; OP = 96%的 D-苯丙氨酸, 收率63%。
关键词: 苯丙氨酸; 氨基酰化酶; 拆分中图分类号: Q814文献标识码: A手性异构体(对映体)的存在是自然界的一种普遍现象,生命界中普遍存在的糖为 [1]D 型, 氨基酸为 L 型。
在医药化学领域中这一点尤为突出,已知药物中约有30%～40%是手性的 。
手性药物(chi-ral drug) 是指有药理活性作用的对映纯化合物。
苯丙氨酸又称 A-氨基-B-苯丙酸,L -苯丙氨酸是人和动物必需的氨基酸之一,还是合成抗病毒和抗癌药物及新型甜味剂的原料,D -苯丙氨酸能增强人体 的免疫功能, 具有出色的镇痛作用。
手性化合物D L -苯丙氨酸的拆分方法很多,其中主要有结晶法、手性试剂法、色谱法、膜分离法及酶拆分法。
酶促拆分法具有催化效率高、专一性强的特点, 而且拆分产物旋光度高、副产物少、产品较 易分离提纯。
特别是氨基酰化酶是较理想的适合拆分的酶,因为其造价低、不需昂贵的辅助因子、对有机溶剂耐受力强, 对氨基酸有较好的立体选择性。
木瓜蛋白酶和猪肾酰化酶都可对N-酰基-D L -氨基酸进行拆分, 但两者所起的作用是不同的。
木瓜蛋白酶促致的是N -酰基-L -氨基酸对芳香胺的酰化反应, 生成酰苯衍生物( 图 1); 猪肾酰化酶则 催化 N -酰基-L -氨基酸的水解反应, 生成 L -氨基酸( 图2) 。
这两种酶对N -酰基-D-氨基酸都没有作 用。
这是它们可对 D L -氨基酸进行拆解的根本原因。
从工业化的可能性来看,采用猪肾酰化酶拆分的方法更简便, 反应步骤少。
故决定采用猪肾酰化酶作为酶促拆分剂。
1 实验部分1. 1 实验材料及仪器猪肾酰化酶I:北京百灵威化学公司 A R; 乙酸酐: 无锡化学试剂厂 A R ; 三乙胺:上海试剂三厂A R ; 浓盐酸: 杭州瓶窑医药化工厂CP ( 36%～38%) ; 乙酸乙酯: 杭州双林化工厂A R ; 茚三酮:上海三 爱思试剂有限公司A R ( > 95% ) ; 氯化钴: 宁波市化学试剂厂A R。
WZZ-2A 型自动旋光仪, 上海精密科学仪器有限公司; PHS-2C 型精密酸度计, 上海精科雷磁;WRR 型熔点测定仪,上海物理光学研究所。
- 1[2] [2]第 1 期 何仕国等 . D L -苯丙氨酸的酶法拆分研究65图1 木瓜蛋白酶拆分 N -乙酰-DL -苯丙氨酸示意图图 2 猪肾酰化酶 I 拆分 N -乙酰-D L -苯丙氨酸示意图F ig 1 T he flow o f the Resolutio n o f N -acety lpheny lalanine by P apainFig 2 T he flo w of the Reso lution of N -acetylpheny lalane by A minoacy lase1. 2 分析方法比旋光度AD = A/ L ×c式中,A 为测得的旋光度;L 为样品试管长度,dm; c为浓度g / ( 100m L )。
光学纯度(opt ic purit y ) (OP )O P=A obs / A max ×100%实验中采用WZZ-2A 自动数显旋光仪测定旋光度,用WR R 型熔点测定仪测定熔点(mp ) 。
酶活测定方法: 25℃, pH7. 0, 1m in 催化1Lmo lN -乙酰-L -苯丙氨酸水解的猪肾酰化酶I 酶量定 义为 1 单位。
购买的纯酶比活为 290000LmolN-乙酰-L -苯丙氨酸/ h/mg 蛋白氮。
1. 3 实验步骤1. 3.1 DL-苯丙氨酸N-乙酰化实验1取16.5g (0. 1mol )DL -苯丙氨酸放入带有冷凝回流管、温度计和搅拌器的250m L 三口烧 瓶中, 将 10g ( 0. 25m ol)N aOH 溶于100m L 水中, 冷却后加到烧瓶中, 搅拌使苯丙氨酸完全溶解,再缓慢滴加乙酸酐13.3mL (0.14mol) ,控制反应温度在30℃以下。
加完后再搅拌约 3h,用茚三酮检测至无紫色出现, 即所有氨基酸都转变成乙酰基化合物 。
用浓盐酸调节 pH 至 2. 0, 冷却,有大量白色片状结晶析出,抽滤,干燥后得N -乙酰-D L -苯丙氨酸 20g , 收率为 96. 6% , mp 147～147.5℃。
1. 3. 2 酶法拆分( 猪肾酰化酶I )实验2～实验7将N -乙酰-D L -苯丙氨酸溶于水, 分别改变溶液的pH 值、反应体系的温度、酶用 量、底物和钴离子浓度, 得到含酶的溶液, 在恒温箱内 37℃下保温 24h, 然后将溶液取出加热10min, 使酶絮凝变性。
过滤除去变性的酶, 将滤液减压蒸馏, 控制温度在 40℃以下, 浓缩至50～100m L ,滴加100mL 无水乙醇, 冷藏过夜, 过滤,滤饼用无水乙醇洗涤2次, 将滤液再次浓缩, 重复上一次操作,得 到少量固体, 保存滤液。
合并2次所得经真空干燥的 L-苯丙氨酸。
详见表2。
1. 3.3 N-乙酰-D -苯丙氨酸的结晶和水解实验8 将实验6所得滤液减压浓缩至干,残渣用少量热水溶解,用 2.5m ol/ L 的硫酸调节pH 至[2]20[3]66化学反应工程与工艺 2004 年到微黄色结晶,过滤干燥。
再用乙酸乙酯溶解,加入干燥乙醚得白色结晶 20N -乙酰-D 20-苯丙氨酸8. 5g,[4]mp 167～169℃, A D= + 48.2°(c= 2,乙醇溶液)。
(文献值:mp 171℃, A D = + 51° (c= 2,乙醇溶液) )。
收率82.1%( 以原料 N -乙酰-DL -苯丙氨酸的 0. 5 倍摩尔量计) , 计算得光学纯度OP = 94.5%。
实验9将结晶得到的N -乙酰-D-苯丙氨酸8. 5g 溶于6m ol/L 的盐酸 150m L ,加热升温, 回流反 应 10h, 然后减压浓缩至固体析出, 再加 10mL 水, 再减压蒸馏至干。
所得固体溶于80℃水, 加入三乙胺调节pH至5.5(等电点) ,加入乙醇使之成为80%乙醇溶液, 有大量白色固体析出, 冷却至5℃以下 保温过夜, 过滤,滤饼用乙醇洗后真空干燥得白色粉末状固体 D -苯丙氨酸 5. 2g , mp279～282℃,A D = + 33. 6°, (c= 2,水溶液)( 文献值:mp 283～284℃, A D = + 35° ) ,O P= 96%, 收率为 63%(以起始原料N -乙酰-D L -苯丙氨酸的0. 5倍摩尔量计)。
2 实验结果及讨论2. 1 N-乙酰化反应N-乙酰化反应为亲电取代反应,芳胺氮原子的电子云密度愈高愈易被酰化,而对酰化剂来说,酰基碳原子所带部分正电荷密度越高越易起酰化作用。
一般常用的酰化剂有羧酸、羧酸酐、酰氯等,其活泼性的大小排列为羧酸< 羧酸酐< 酰氯。
用羧酸对苯丙氨酸酰化的反应速率很慢 。
另外还做了对比实验, 也使用乙酸酐为酰化剂, 分别就两条不同的合成 N-乙酰-D L -苯丙氨酸的路线进行了试验,从收率和最后得到的产物的熔点的分析来看, 两条路线都是切实可行的( 表 1)。
在乙酰化反应中, 终点的控制是采用氨基酸与茚三酮(ninhy drin)的显色反应。
表 1 DL-苯丙氨酸 N-乙酰化合成不同路线比较Table 1 The Diff erent Methods for the Synthesis of N-acetylphenylalanine实验序号 物料 收率, %熔点/℃1苯丙氨酸、乙酸、乙酸酐 78. 7147～148对比实验 1苯丙氨酸、NaOH 、乙酸酐 96. 6147～147.52. 2 pH值对酶法拆分的影响实验3 对此进行了一定的探索,从实验结果( 表2, 图3)可以看出 pH 值对酶促反应的影响很 大,当pH 值过高或过低时, 不但影响最终产品的收率, 还影响产品的纯度,所得产品的旋光度达不到要求,这可能是因为在过酸或过碱的条件下,酶活降低且旋光性物质有一定程度上的消旋。
比较适宜 的pH 值为7.0。
表 2 酶促拆分的影响因素考察Table 2 The Inf lucing Factors on the Resolution by Aminoacylase序号 氨酸量/gm ol ・L mol ・L -12 20. 7 50 7. 0 37 0. 1 0 24 98 66.7 3(a) 20. 7 50 5. 0 37 0. 1 0 24 86. 6 23. 0 3(b) 20.7 506.370.1 0 2498.3 48.5 3(c) 20. 7 50 8. 0 37 0. 1 0 24 82. 8 42.4 4(a) 20. 7 50 7. 0 20 0. 1 0 48 92. 3 30. 3 4(b) 20.7 507.300.1 0 2493.1 49.7 4(c) 20. 7 50 7. 0 42 0. 1 0 24 91. 4 19.4 5(a) 20. 7 50 7. 0 37 0. 05 0 24 98.6 50.9 5(b) 20. 7 507.37 0. 2 0 24 97. 4 64.2 6 20. 7 50 7. 0 37 0. 1 0. 001 24 98. 8 70.3 7(a) 20. 7 100 7. 0 37 0. 1 0. 001 24 97. 4 71.5 20 20[5] [6] 2+酶量/mgpH 温度/℃ 时间/h OP , % 收率, %第 1 期 何仕国等 . D L -苯丙氨酸的酶法拆分研究67Fi g图 3 pH 对光学纯度 OP 和得率 Y 的影响 3 T he Influence of pH on the OP a nd Y ield F ig 4 图 4 温度对光学纯度 O P 和得率 Y 的影响T he Influence o f T emper ature o n t he O P and Y ield2. 3 反应温度对酶法拆分的影响实验4 就温度的影响进行了一系列的试验,从表2和图4看出,较适宜的温度为37℃。