病毒转染原理及步骤
转染的原理(一)
转染的原理(一)转染：从表面了解到深入探究转染是一种常见的细胞实验技术，用于将外源基因（如DNA、RNA）引入到目标细胞中。
这种技术在生物医学研究中扮演着重要的角色，为我们了解基因功能、疾病机制和药物研发提供了有力的工具。
本文将从浅入深，逐步解释转染的原理和相关技术。
1. 什么是转染转染是指通过特定的操作将外源基因导入目标细胞内的过程。
这些外源基因可以是质粒DNA、RNA、病毒等，用于引入特定的基因组、表达序列或功能性分子到目标细胞中。
转染技术通常用于研究基因功能及其调控、蛋白质表达、疾病模型的构建等方面。
2. 转染的方法分类转染方法可以分为两大类：非病毒转染和病毒转染。
非病毒转染非病毒转染是指利用非病毒载体将外源基因导入目标细胞内的方法。
常见的非病毒转染方法有以下几种：•Calcium Phosphate Coprecipitation（磷酸钙共沉淀法）：通过混合磷酸钙和DNA溶液，形成肥大的复合物，在细胞培养基中直接与细胞接触，使DNA转染入细胞。
•Liposome-mediated Transfection（脂质体介导转染）：利用合成的脂质体，包裹外源DNA，形成脂质体-质粒DNA复合物。
此复合物在细胞表面被摄取，使DNA进入细胞质。
•Electroporation（电穿孔法）：通过使用电脉冲，暂时增加细胞膜的通透性，使DNA能够直接进入细胞质。
病毒转染病毒转染是指利用病毒作为载体将外源基因导入目标细胞内的方法。
病毒能够侵入细胞并将其基因组整合到宿主细胞中，从而实现基因转移。
常用的病毒转染方法包括：•腺病毒（Adenovirus）转染：通过改变腺病毒的基因组，将目标基因插入其中，然后将重组病毒加入到细胞培养中，使之感染目标细胞。
•慢病毒（Retrovirus）转染：将目标基因组插入慢病毒的基因组中，经过转染后，被转染细胞会在其DNA中稳定整合慢病毒的遗传物质。
•腺相关病毒（Adeno-associated virus）转染：此病毒结构相对简单，对宿主的感染能力低，并且不会整合到宿主细胞DNA中，因此安全性较高。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
什么是转染实验的原理
什么是转染实验的原理
转染实验是指将外源性的基因导入到受试细胞内,使其获得新的生物学功能的一种重要的分子生物学实验方法。
其基本原理是:1. 选取一个适当的载体载体是携带外源基因进入受试细胞的载体。
常用的有质粒、病毒载体等。
载体需要具备携带基因的能力,同时对细胞也要有一定的亲和力。
2. 构建重组载体将需转入细胞内的目的基因连接到载体上,构建成重组载体。
这需要运用一些基因工程手段,如restriction酶切割、连接酶连接等。
3. 转染载体入细胞有多种方法可以将重组载体送入受试细胞,如阳离子脂质体法、电穿孔法、病毒感染法等。
转染后,细胞会吸收载体。
4. 载体在细胞内表达载体进入细胞后,需要在细胞内正确表达,产生目的蛋白质。
需要载体具有组成可自主复制或整合入细胞基因组的能力。
5. 筛选成功的重组细胞不是所有细胞都会转染成功。
需要设计筛选标记,比如赋予细胞抗生素耐药性,然后用含抗生素的培养基进行筛选。
6. 鉴定转染结果需要用一些手段鉴定转染细胞是否获得了新功能,如PCR、Western blotting等检测新基因或蛋白的表达。
7. 分析转染的生物学效果观察转染基因对细胞生长、形态、功能等产生的影响,分析基因的生物学效应,这是转染实验的最终目的。
转染实验可以改变细胞的遗传特性,是揭示基因功能、发展基因治疗等的重要手段。
但每种细胞和基因都有特异性,需要设计针对性的转染方案,并严格验证转染效果。
(待分)病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：构建载体包装提纯病毒感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（）载体是以（人类免疫缺陷型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为，克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
病毒转染原理及步骤之欧阳索引创编
病毒转染原理及步骤欧阳家百（2021.03.07）在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
转染的原理
转染的原理转染是生物学实验中常用的一种技术，它是指将外源DNA或RNA引入到细胞内的过程。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
本文将从转染的原理入手，介绍转染技术的基本概念、原理和常见方法。
转染的基本概念。
转染是指将外源核酸（DNA或RNA）引入到细胞内，并使其稳定地表达或转录的过程。
通过转染技术，可以实现对细胞内基因的敲除、过表达或靶向修饰，从而研究基因功能、调控细胞信号通路、开发新药物等。
转染的原理。
转染的原理主要包括细胞膜通透性增加、核酸与细胞膜的相互作用、内吞作用和核酸的释放等过程。
在转染过程中，外源核酸首先需要穿过细胞膜，进入到细胞内部。
然后，外源核酸需要与细胞内的生物分子发生相互作用，从而实现其稳定的表达或转录。
最后，外源核酸需要在细胞内定位到特定的细胞器或亚细胞结构，发挥其功能。
常见的转染方法。
目前，常见的转染方法包括化学法、生物物理法和病毒载体法等。
化学法是指利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）改变细胞膜的通透性，使外源核酸能够进入到细胞内。
生物物理法是指利用物理手段（如电穿孔、微注射等）将外源核酸导入到细胞内。
病毒载体法是指利用病毒载体将外源核酸传递到细胞内，并实现其表达或转录。
转染技术的应用。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因工程领域，转染技术被用于敲除或过表达特定基因，从而研究基因功能和调控信号通路。
在细胞生物学领域，转染技术被用于标记细胞器、跟踪蛋白质定位和研究细胞信号转导等。
在药物研发领域，转染技术被用于筛选潜在的药物靶点、评估药物毒性和研究药物的作用机制等。
结语。
总之，转染技术是一种重要的生物学实验技术，它在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
通过对转染的原理和常见方法的了解，可以更好地应用转染技术进行科研工作，推动生命科学领域的发展和进步。
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
转染实验报告原理
一、引言转染实验是分子生物学和细胞生物学领域常用的技术之一，主要用于将外源DNA或RNA分子导入细胞内，使其在细胞内表达，从而研究基因功能、基因调控等生物学问题。
本文将详细阐述转染实验的原理，并探讨其在生物学研究中的应用。
二、转染实验原理1. 转染过程转染过程主要包括以下几个步骤：（1）外源DNA或RNA分子的制备：通过PCR、化学合成或克隆等方法获得目的基因，并将其克隆到表达载体或报告基因载体上。
（2）转染试剂的选择：根据细胞类型和实验需求，选择合适的转染试剂，如脂质体、聚合物、电穿孔等。
（3）转染操作：将外源DNA或RNA分子与转染试剂混合，加入细胞培养液中，在一定条件下使转染试剂与细胞膜接触，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。
（4）基因表达：外源DNA或RNA分子进入细胞后，通过转录和翻译过程，使目的基因在细胞内表达。
2. 转染原理转染实验的原理主要包括以下几种：（1）脂质体介导的转染：脂质体是一种由磷脂分子组成的微小囊泡，具有生物相容性和靶向性。
将外源DNA或RNA分子与脂质体混合，通过脂质体与细胞膜的相互作用，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。
（2）聚合物介导的转染：聚合物介导的转染是通过聚合物与细胞膜相互作用，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。
常用的聚合物有聚乙二醇（PEG）、聚赖氨酸等。
（3）电穿孔转染：电穿孔转染是通过高电压脉冲使细胞膜产生短暂孔洞，使外源DNA或RNA分子进入细胞内。
三、转染实验应用1. 基因功能研究转染实验可用于研究基因功能，如：（1）基因敲除：通过转染短发夹RNA（shRNA）或siRNA，使目的基因表达沉默，研究基因在细胞功能中的作用。
（2）基因过表达：通过转染表达载体，使目的基因在细胞内过表达，研究基因在细胞功能中的作用。
2. 基因调控研究转染实验可用于研究基因调控，如：（1）启动子分析：通过转染报告基因载体，检测启动子活性，研究基因调控元件。
（2）转录因子功能研究：通过转染转录因子表达载体，研究转录因子对基因表达的影响。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步调之吉白夕凡创作在细胞相关的实验操纵中，对于一些按惯例方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包含以下步调：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供发生病毒颗粒所必须的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点拔出的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为发生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及陈述基因的研究提供了一个有利的途径。
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步伐之马矢奏春创作在细胞相关的实验把持中,对一些按惯例方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够年夜年夜提高基因的转导效率,以到达目的基因的高效瞬时表达.病毒转染包括以下步伐：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞.以慢病毒为例.慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而到达耐久性表达.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而到达良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景.一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部份组成,即包装成份和载体成份.包装成份由HIV-1基因组去除包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供发生病毒颗粒所必需的卵白；载体成份则与包装成份互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点拔出的目的基因.将包装成份与载体成份的多个质粒共转染包装细胞,即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒.慢病毒表达载体包括了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助卵白.为发生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.对一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能年夜年夜提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率年夜年夜增加,这就为RNAi,cDNA克隆以及陈说基因的研究提供了一个有利的途径.对进行稳转细胞株的筛选,为活体植物模型实验提供高质量的包括目的基因的病毒液提供基础.二、慢病毒载体构建及包装流程：（一）实验流程（1和2为并列步伐）1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采纳高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体.将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体.2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿越质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养基,培养24和48h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒.（二）实验资料：慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光卵白（GFP）.细胞株 293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞.菌株年夜肠杆菌菌株DH5α.用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒.三、慢病毒转染细胞实验方法（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中.使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右.2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液.37℃孵育.3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步伐)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene.4、继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基.5、继续培养.如果慢病毒含有荧光卵白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显.如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行.如果慢病毒含有抗性基因而且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药.（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒,充沛混匀.37℃孵育.或者150g室温离心4小时(选作,部份难转染的细胞系采纳此步伐可以提高转染效率).2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步伐)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene.3、继续培养3-4天.中间视细胞生长情况可传代或换液.病毒感染细胞原本效率就较低,一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene （贮存液浓度为2mg/ml ）,可以提高效率约3-5倍.不外病毒感染效率的问题都是相对的,到达自己的研究目的即可.北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病毒感染增强试剂(病毒转染试剂)EnvirusTM,具有对病毒吸附和独占的浓缩功能.EnvirusTM通过物理作用将病毒年夜量富集在细胞概况,年夜年夜增加病毒与细胞的接触,最年夜限度增进病毒感染细胞,可年夜年夜提高腺病毒,慢病毒,腺相关病毒,逆转录病毒等病毒的感染效率,而且细胞毒性很小.通常情况下,比不用EnvirusTM增强剂,提高感染效率20-50倍.病毒感染细胞原本效率就较低,整个过程相对复杂难把持,一般一次花费周期至少两三个月,多则几个月到十几个月不等,经费也是几万到十几万.万一实验失败需要重复把持会花费更多的时间和开支.所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的关键.。
病毒转染原理及步骤
病毒转染本理及步调之阳早格格创做正在细胞相闭的真验支配中，对付于一些按惯例要领易以转染以至无法转染的细胞，通过病毒介导的真验不妨大大普及基果的转导效用，以达到手段基果的下效瞬时表黑.病毒转染包罗以下步调：1构修载体2包拆提杂病毒3熏染靶细胞.以缓病毒为例.缓病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为前提死少起去的基果治疗载体.辨别普遍的顺转录病毒载体，它对付团结细胞战非团结细胞均具备熏染本领.缓病毒载体的钻研死少得很快，钻研的也非常深进.该载体不妨将中源基果灵验天调整到宿主染色体上，进而达到少期性表黑.正在熏染本领圆里可灵验天熏染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、搞细胞等多种典型的细胞，进而达到良佳的的基果治疗效验，正在好国已经开展了临床钻研，效验非常理念，果此具备广阔的应用前景.一、缓病毒载体构修本理：缓病毒载体的包拆系统普遍由二部分组成，即包拆身分战载体身分.包拆身分由HIV-1基果组去除了包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列而构修，不妨反式提供爆收病毒颗粒所必须的蛋黑；载体身分则与包拆身分互补，即含有包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列，共时具备同源开用子统造下的多克隆位面及正在此位面拔出的手段基果.将包拆身分与载体身分的多个量粒共转染包拆细胞，即可正在细胞上浑中支获携戴手段基果的复造缺陷型缓病毒载体颗粒.缓病毒表黑载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息.缓病毒包拆量粒可提供所有的转录并包拆RNA 到沉组的假病毒载体所需要的所有辅帮蛋黑.为爆收下滴度的病毒颗粒，需要利用表黑载体战包拆量粒共时共转染细胞，正在细胞中举止病毒的包拆，包拆佳的假病毒颗粒分泌到细胞中的培植基中，离心博得上浑液后，不妨曲交用于宿主细胞的熏染，手段基果加进到宿主细胞之后，通过反转录，调整到基果组，进而下火仄的表黑效力分子.对付于一些较易转染的细胞，如本代细胞、搞细胞、没有瓦解的细胞等,能大大普及手段基果转导效用，而且手段基果调整到宿主细胞基果组的几率大大减少，那便为RNAi，cDNA克隆以及报告基果的钻研提供了一个有利的道路.对付举止稳转细胞株的筛选，为活体动物模型真验提供下品量的包罗手段基果的病毒液提供前提.二、缓病毒载体构修及包拆过程：（一）真验过程（1战2为并列步调）1.缓病毒过表黑量粒载体的构修造计上下游特同性扩删引物，共时引进酶切位面，PCR(采与下保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA量粒大概者文库）调与手段基果CDS区（coding sequence）连进T载体.将CDS区从T载体上切下，拆进缓病毒过表黑量粒载体.2.缓病毒搞扰量粒载体的构修合成siRNA对付应的DNA颈环结构，退火后连进缓病毒搞扰量粒载体3. 缓病毒载体的包拆与浓缩杂化造备缓病毒脱梭量粒及其辅帮包拆本件载体量粒，三种量粒载体分别举止下杂度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 调换为真足培植基，培植24战48h后，分别支集富含缓病毒颗粒的细胞上浑液，病毒上浑液通过超离心浓缩病毒.（二）真验资料：缓病毒载体、包拆细胞战菌株该病毒包拆系统为三量粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中量粒上的ZsGreen1表黑框能表黑绿色荧光蛋黑（GFP）.细胞株293T，缓病毒的包拆细胞，为揭壁依好型成上皮样细胞，死少培植基为DMEM(含10% FBS).揭壁细胞经培植死少删殖产死单层细胞.菌株大肠杆菌菌株DH5α.用于扩删缓病毒载体战辅帮包拆载体量粒.三、缓病毒转染细胞真验要领（一）缓病毒转染揭壁细胞真验要领1、缓病毒转染前18-24小时，将揭壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中.使细胞正在缓病毒转染时的数量为2×105/孔安排.2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新陈培植基替换本培植基，加进适量病毒悬液.37℃孵育.3、(对付polybrene毒性敏感的细胞选做此步调)4小时后加进2ml新陈培植基以密释polybrene.4、继承培植24小时，用新陈培植基替换含有病毒的培植基.5、继承培植.如果缓病毒含有荧光蛋黑，普遍转染48小时后可睹明隐荧光表黑，72小时后越收明隐.如需FACS检测转染效用，可正在转染后72-96小时举止.如果缓病毒含有抗性基果而且需要加药筛选，不妨正在转染3-4天后开初加药.（二）缓病毒转染悬浮细胞真验要领1、正在2×105/ml悬浮细胞中加进polybrene至6 μg/ml战适量病毒，充分混匀.37℃孵育.大概者150g室温离心4小时(选做，部分易转染的细胞系采与此步调不妨普及转染效用).2、(对付polybrene毒性敏感的细胞选做此步调)4小时后(大概离心中断后)加进等体积新陈培植基以密释polybrene.3、继承培植3-4天.中间视细胞死少情况可传代大概换液.病毒熏染细胞本本效用便较矮，一定要注意以下几面：1.熏染时的培植基尽管少些；2. 每1ml的培植基中加进5-10ul 的Polybrene（储藏液浓度为2mg/ml ），不妨普及效用约3-5倍.没有过病毒熏染效用的问题皆是相对付的，达到自己的钻研手段即可.北京英格恩死物公司最新研收合成一种新式纳米散合物病毒熏染巩固试剂(病毒转染试剂)EnvirusTM，具备对付病毒吸附战独有的浓缩功能.EnvirusTM通过物理效用将病毒洪量富集正在细胞表面，大大减少病毒与细胞的交触，最大极限促进病毒熏染细胞，可大大普及腺病毒，缓病毒，腺相闭病毒，顺转录病毒等病毒的熏染效用，而且细胞毒性很小.常常情况下，比没有必EnvirusTM巩固剂，普及熏染效用20-50倍.病毒熏染细胞本本效用便较矮，所有历程相对付搀杂易支配，普遍一次耗费周期起码二三个月，多则几个月到十几个月没有等，经费也是几万到十几万.万一真验波折需要沉复支配会耗费更多的时间战开销.所以灵验普及病毒转染效用是病毒转染细胞的闭键.。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
2020年病毒转染原理及步骤.pptx
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具 有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可 有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多 种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究， 效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
学海无涯 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行 高纯度无内毒素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基， 培养 24 和 48h 后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液 通过超离心浓缩病毒。
（二） 实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的 ZsGreen1 表达框能 表达绿色荧光蛋白（GFP）。 细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培 养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
学海无 涯 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装 质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋 白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心 取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后， 经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
病毒转染细胞原理
病毒转染细胞原理
病毒转染细胞原理是一门复杂的科学，它涉及病毒的特性和细胞的生物学特性，以及两者之间的交互作用。
病毒转染细胞其实是利用病毒传播基因来影响细胞，使其表现出异常的生物学特性。
首先，病毒会进入细胞，并使用其内部的机器来复制其遗传物质，从而产生新
的病毒粒子。
复制完成后，病毒粒子会逃离细胞，并将转录RNA携带的病毒基因转入其他细胞。
一旦这种转化发生，新的病毒就会继续有生命力，并且可以编码出各种不同的蛋白质，从而影响像抗生素抵抗力、细胞周期、蛋白质合成等等细胞重要功能。
其次，病毒还可以降解细胞中的细胞核膜，从而将基因转化到细胞内。
这种情
况发生在当病毒感染细胞后，细胞中开始分泌一种叫做“囊泡”的蛋白质，这种囊泡可以将病毒基因包裹起来，把它们带到细胞内，在细胞核内“共享”封装的病毒基因。
最后，病毒感染的细胞可能会触发一种叫做“基因编辑”的蛋白质，从而完成
病毒的传播和基因转换作用。
这种蛋白质允许病毒传染的细胞能够将病毒的基因直接植入细胞DNA，从而可以对细胞的特定基因进行改变，使其具有某些新的特性。
总之，病毒转染细胞原理是一种复杂的生物学知识，可以为我们精准地洞察病
毒感染细胞及其影响，为医学研究和抗病毒研究奠定基础，并为临床干预提供新的手段。
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病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
L■町析*riVMvsIk]?对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理
慢病毒转染是一种常用的基因传递技术，它利用慢病毒病毒粒子作为载体将目标基因导入靶细胞。
慢病毒是一类特殊的病毒，具有较高的感染效率和稳定的基因表达能力，因此被广泛应用于基因转染领域。
慢病毒转染的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 构建慢病毒载体：首先，将目标基因插入到慢病毒载体的适当位点上。
慢病毒载体通常包括了病毒的基因组结构，例如表达型蛋白、包装型蛋白等。
2. 包装慢病毒：将构建好的慢病毒载体导入特定细胞系，并通过培养和传代扩增病毒。
这些细胞会产生足够多的慢病毒病毒颗粒。
3. 收集病毒颗粒：从培养基中收集慢病毒病毒颗粒。
通常，病毒颗粒可以通过浓缩和超速离心等方法获得。
4. 转染靶细胞：将收集到的病毒颗粒加入待转染的靶细胞培养基中。
病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，进入细胞。
5. 病毒基因组整合到靶细胞基因组：一旦进入细胞内，慢病毒会释放出自己的遗传物质，包括病毒基因组RNA和逆转录酶。
逆转录酶能够将病毒基因组的RNA逆转录成DNA，并将其整合到宿主细胞的染色体上。
从而实现病毒基因的稳定表达。
综上所述，慢病毒转染是一种利用慢病毒病毒粒子作为载体将基因导入到靶细胞的技术。
通过包装慢病毒病毒颗粒，并与靶细胞进行转染，实现了基因的稳定表达。
这种技术在基因治疗、基因功能研究等领域具有重要的应用价值。
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病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。
慢病毒(Ｌenｔｉviruｓ）载体是以HIV－1(人类免疫缺陷Ｉ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究，效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。
病毒转染原理及步骤
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病毒转染原理及步骤
在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达。
4、继续培养2４小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。ﻫ５、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显。如需ＦＡCS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染３-4天后开始加药。ﻫ(二)慢病毒转染悬浮细胞实验方法ﻫ1、在2×1０5／mｌ悬浮细胞中加入polybrene至6μｇ/ml和适量病毒,充分混匀。３7℃孵育。或者1５０g室温离心4小时（选作,部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。ﻫ2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)４小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释ｐｏlyｂｒenｅ。ﻫ3、继续培养3-４天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
（二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为ｐsｐaｘ２,ｐMD2Ｇ, pLVＸ-ＩRＥS-ZｓＧrｅeｎ1/pLVＸ－shRＮA2。其中质粒上的ZsGｒeen1表达框能表达绿色荧光蛋白(ＧFP）。
细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DＭEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
（一）实验流程（1和2为并列步骤)ﻫ1.慢病毒过表达质粒载体的构建ﻫ设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCＲ（采用高保真KOD酶,3K内ｅqｕｅncｅ)连入T载体。将CＤS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。ﻫ２．慢病毒干扰质粒载体的构建
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录,整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
一、慢病毒载体构建原理：
慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV－1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞,即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为RNＡｉ,cDNＡ克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。
二、慢病毒载体构建及包装流程：
病毒感染细胞本来效率就较低,整个过程相对复杂难操作,一般一次花费周期至少两三个月,多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万。万一实验失败需要重复操作会花费更多的时间和开支。所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的关键。
菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、慢病毒转染细胞实验方法
(一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-２4小时，将贴壁细胞以1×1０5／孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。ﻫ2、第二天,用含有6μｇ/ml poｌybrenｅ的2ml新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液。３7℃孵育。ﻫ3、(对pｏlｙbrenｅ毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入２ｍl新鲜培养基以稀释pｏlybrene。
病毒感染细胞本来效率就较低,一定要注意以下几点:１.感染时的培养基尽量少些；2.每1ml的培养基中加入5－1０ul的Pｏlybｒｅnｅ（储存液浓度为2mｇ/ｍｌ),可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。
北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病毒感染增强试剂（病毒转染试剂）EnvirusTＭ，具有对病毒吸附和独有的浓缩功能。EnvirusＴM通过物理作用将病毒大量富集在细胞表面，大大增加病毒与细胞的接触,最大限度促进病毒感染细胞,可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相关病毒,逆转录病毒等病毒的感染效率,并且细胞毒性很小。通常情况下，比不用ＥnvirｕsTM增强剂,提高感染效率20-５0倍。