DNA与蛋白质结合的共振光散射研究及应用
dna和蛋白互作的研究方法
dna和蛋白互作的研究方法DNA和蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们的相互作用在细胞的正常功能和疾病发生中起着重要作用。
为了深入理解它们之间的相互作用机制，科学家们开展了各种研究方法。
本篇文章将介绍几种常用的DNA和蛋白质互作研究方法。
1. 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用的方法。
该方法基于抗体的特异性识别能力，将目标蛋白质结合在免疫球蛋白上，然后通过洗涤步骤来去除未结合的蛋白质。
最后，通过对共沉淀复合物进行Western blot或质谱分析来确定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或DNA。
2. 酵母双杂交实验（Yeast Two-Hybrid）酵母双杂交实验是一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。
该方法利用酵母细胞质外部分和细胞核内部分蛋白质相互作用的特性。
通过构建适当的融合蛋白，例如，将目标蛋白质与激活因子结合，将库蛋白质与DNA结合，形成功能性的转录激活复合物，从而检测蛋白质相互作用。
3. 荧光共聚焦显微镜（Fluorescence confocal microscopy）荧光共聚焦显微镜是一种用于研究DNA和蛋白质互作的分子显微镜技术。
该技术基于荧光标记的DNA或蛋白质，能够直接观察其在细胞内的相互作用。
通过激发特定的荧光标记来可视化相互作用的位置和动力学。
此外，使用荧光共聚焦显微镜还可以研究DNA和蛋白质在细胞周期、发育和转录调控等过程中的互作。
4. 原位免疫共沉淀（In Situ Proximity Ligation Assay）原位免疫共沉淀是一种用于检测细胞内DNA和蛋白质之间相互作用的方法。
该方法主要通过荧光和免疫组织化学方法来标记和检测位于亲近的蛋白质和DNA的抗体-抗原复合物。
这种方法具有高度的特异性和灵敏性，可以在单个细胞水平上研究DNA和蛋白质之间的互作。
5. 电子显微镜（Electron microscopy）电子显微镜是一种高分辨率显微镜技术，可用于研究DNA和蛋白质的互作。
蛋白与dna互作的研究方法
蛋白与dna互作的研究方法蛋白与DNA互作的研究方法涉及到生物化学、分子生物学和生物物理学等多个学科领域，通过这些方法可以深入了解蛋白与DNA之间的相互作用机制。
下面将介绍几种常用的研究方法：1. 共沉淀实验：共沉淀实验是一种常用的方法，用于研究蛋白与DNA之间的相互作用。
通过共沉淀实验，可以验证蛋白和DNA是否能够相互结合形成复合物。
实验过程中，首先将目标蛋白和DNA混合，然后加入沉淀剂使复合物沉淀下来，最后通过离心将复合物与其他物质分离，最终通过Western blot或PCR等方法检测复合物的形成。
2. EMSA实验：电泳迁移率变化实验（EMSA）是一种常用的方法，用于研究蛋白与DNA结合的特异性。
实验过程中，将目标蛋白与DNA混合，然后进行凝胶电泳，根据蛋白与DNA复合物的电泳迁移率变化来判断二者的结合情况。
通过这种方法，可以验证蛋白与DNA的结合位置和亲和力。
3. 免疫共沉淀实验：免疫共沉淀实验是一种用于研究蛋白与DNA互作的方法，该方法结合了免疫沉淀和共沉淀的原理。
实验过程中，将抗体与目标蛋白结合，然后将混合物与DNA共沉淀，最后通过Western blot或PCR等方法检测蛋白与DNA 的结合情况。
这种方法可以用来验证蛋白与DNA的直接相互作用。
4. 超分辨成像技术：近年来，随着超分辨成像技术的发展，研究人员可以更加精细地观察蛋白与DNA的相互作用。
通过单分子成像技术，可以实时观察蛋白与DNA之间的动态过程，揭示二者之间的结合情况和空间分布。
这种方法在揭示蛋白与DNA互作机制方面具有重要的应用价值。
总的来说，蛋白与DNA互作的研究方法涉及到多种实验技术，研究人员可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法来深入探究二者的相互作用机制。
通过这些方法的应用，可以更加全面地理解蛋白与DNA的互作关系，为生物学研究和药物开发提供重要的参考依据。
DNA与蛋白质的相互作用--试验方法
今天学习DNA与蛋白质的相互作用--试验方法1. DNaseI足迹试验（DNaseI Footprinting）：是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
试验过程：首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子，而后在体外同细胞蛋白质提取物混合。
待二者结合之后，再加入少量的DNaseI(它可沿着靶DNA作随机单链切割)消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。
如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差—个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。
从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNaseI切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。
但是，如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。
足迹试验的一个明显的优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。
如果使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。
如同凝胶阻滞试验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。
所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射性标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。
应用DNaseⅠ足迹试验确定转录因子Sp1在HBV表面抗原启动子的结合位点为-4 9～-29核苷酸序列之间。
2. 凝胶阻滞试验(gel retartion assay)：又叫做DNA迁移率变动试验(DNA mo bility shtft assay)，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝放电泳技术。
共振光散射光谱测定
共振光散射光谱测定
共振光散射（Resonance Light Scattering，RLS）是一种用于分析样品的光散射技术。
它利用样品中某些特定分子或物质与特定波长的光产生共振效应，进而引起散射光的增强现象。
这种技术在分析化学和生物化学等领域有着广泛的应用。
共振光散射光谱测定的原理基于样品中某些分子或物质与特定波长的光相互作用的结果。
当光线与样品中特定分子的共振波长相匹配时，样品会吸收光的能量，然后以散射光的形式重新辐射出来。
这种重新辐射会导致散射光的强度增加，形成共振光散射峰。
这种峰的出现可以用于检测和定量分析样品中特定物质的存在和浓度。
共振光散射光谱测定常常需要精确控制光源、检测器和样品的制备条件。
通过测量散射光的强度、波长和特征峰来分析样品中特定物质的含量或性质。
这种技术在生物化学、药物分析、环境监测等领域具有重要的应用价值。
要进行共振光散射光谱测定，通常需要专门的光学仪器和精确的样品处理技术。
研究人员通常需要了解样品的特性，并采用合适的波长和实验条件来实施测定。
具体的实验步骤和分析方法会根据不同的应用领域和样品类型而有所不同。
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共振光散射技术
共振光散射技术
共振光散射技术是一种研究散射现象的技术，它涉及到光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光学现象。
该技术利用共振瑞利散射(Resonance Rayleigh Scattering, RRS)的原理，当光与分子发生弹性碰撞时会产生瑞利散射，即散射光波长等于入射光波长。
在共振光散射中，当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射。
共振光散射技术常用于研究半径很小的散射粒子，其光散射信号主要成分是共振瑞利散射。
该技术具有广泛的应用前景，在胶体化学和高分子溶液研究方面有广泛的应用。
例如，它可以用于测定聚合物的聚集行为，以及研究生物大分子的装配、超分子排列和生物大分子的测定等。
共振光散射光谱的测定通常在较大的激发和发射单色器狭缝宽度（≥5nm）下进行，在此情况下所获得的共振光散射光谱中含有动态光散射成分。
另外，当散射体系中含有较大的散射粒子或能发射Stokes很小的荧光组分时，共振光散射信号还含有Tyndall散射和荧光等信号。
因此，通常获得的共振光散射光谱并非单纯的共振瑞利散射，还有动态光散射、Tyndall散射及荧光等信号。
总之，共振光散射技术是一种利用光学手段研究物质性质的重要技术，其应用前景广泛，特别是在生物大分子和胶体化学等领域有重
要作用。
共振散射技术
共振散射技术引言共振散射技术是一种基于物质与电磁波相互作用的测量方法，通过测量散射光的频率和强度来分析样品的物理性质。
本文将详细介绍共振散射技术的原理、应用以及未来的发展方向。
原理共振散射技术基于散射现象，当电磁波与样品相互作用时，部分能量会被散射出去。
共振散射是指当入射光的频率接近样品固有频率时，散射光的强度显著增加。
这是因为入射光的能量与样品中的共振模式相互作用，导致能量传输到散射光中。
应用领域生物医学领域共振散射技术在生物医学领域有广泛的应用。
例如，可以利用共振散射技术对细胞和组织样品进行非侵入性的分析。
通过测量散射光的频率和强度，可以获得关于样品的形态、结构和功能信息，从而帮助研究人员了解细胞和组织的特性。
材料科学领域在材料科学领域，共振散射技术被广泛应用于材料的表征和分析。
通过测量散射光的频率和强度，可以获得关于材料的晶格结构、晶体缺陷和表面形貌等信息。
这对于研究材料的物理性质、优化材料的性能以及开发新型材料具有重要意义。
环境监测领域共振散射技术在环境监测领域也有广泛的应用。
例如，可以利用共振散射技术对大气中的颗粒物进行监测和分析。
通过测量散射光的频率和强度，可以获得关于颗粒物的大小、浓度和化学成分等信息，从而帮助研究人员了解大气污染情况和采取相应的控制措施。
发展趋势共振散射技术在过去几十年中取得了重要的进展，但仍存在一些挑战和限制。
未来的发展方向主要包括以下几个方面：提高测量精度目前的共振散射技术在测量精度上还有提升的空间。
研究人员可以通过改进实验装置和算法等手段，提高散射光的测量精度，从而获得更准确的样品信息。
拓宽应用范围共振散射技术在生物医学、材料科学和环境监测等领域已经得到了广泛应用，但仍有其他领域可以进一步拓宽应用范围。
例如，在能源领域可以利用共振散射技术研究新型能源材料的性质和性能。
结合其他技术共振散射技术可以与其他技术相结合，从而实现更多样化的分析和测量。
例如，结合光谱技术可以获得更详细的样品信息，结合显微镜技术可以实现对微观结构的观察和分析。
蛋白质与DNA相互作用的研究
蛋白质与DNA相互作用的研究随着生物学研究水平不断提高，对生物分子间相互作用的研究也越来越深入，其中蛋白质和DNA之间的相互作用就是一个重要的研究方向。
蛋白质和DNA相互作用对于细胞的正常功能、基因表达、细胞凋亡等方面都有重要的影响，因此对于这种相互作用的了解，可以深入了解生物体内各个分子之间错综复杂的关系。
首先，我们要介绍的是蛋白质对DNA的识别方式。
在细胞内，蛋白和DNA结合是一种特定的结合模式，其中有一些特定的氨基酸序列和DNA底物相结合，从而对其进行识别和连接。
例如在DNA复制和转录过程中，用于与DNA交互的蛋白质是RNA聚合酶和DNA聚合酶，这些蛋白质通过识别特定的氨基酸序列，接合到DNA链条中，这种结合模式对于基因表达过程中起到了至关重要的作用。
此外，还有一些蛋白质与DNA的配课机制与纤维素等复杂酶和DNA相关，这种识别方式需要对分子结构进行更加深入的了解，从而为基因治疗、新型药物的设计等方面提供理论依据。
其次，我们想要探究的是蛋白质与DNA相互作用的影响因素。
首先，一些物理化学性质，如电荷、亲水性等，都直接影响蛋白质与DNA相互作用的结果。
一些生化环境、例如温度、pH等条件的变化都可能会改变蛋白质的结构，从而影响其与DNA的相互作用。
此外，当蛋白质中含有可以与某些DNA结构互相作用的特定基团，例如磷酸、转录因子、受体等，这导致蛋白质与DNA的互作效果明显增强，并且可以改变DNA链的构象。
最后，我们需要探究的是一些在研究蛋白质与DNA相互作用时所需要的策略和技术。
核磁共振是一种常规技术，用于研究生物大分子的结构、动力学和分子间相互作用等方面。
定向海拔是蛋白质与DNA相互作用的重要工具，利用DNA凝胶退火技术可以实现高通量的蛋白质和DNA互作策略。
此外，还有一些现代高通量的技术，例如分子动力学模拟、微流控技术和蛋白芯片技术等，这些技术以其高通量、高精度的特点，被广泛应用于生物分子间相互作用的研究领域。
DNA-蛋白质交联的研究进展
DNA-蛋白质交联的研究进展DNA-蛋白质交联是一种重要的生物化学过程，它在细胞内发挥着关键的作用。
DNA-蛋白质交联是指DNA分子和蛋白质之间的相互作用，它能够调控基因的表达、维持染色体结构、参与DNA修复和复制等多种生物学过程。
近年来，科学家们对DNA-蛋白质交联的研究取得了令人瞩目的进展，不仅揭示了其在细胞生物学中的重要作用，还为人类疾病的治疗和诊断提供了新的思路。
本文将从DNA-蛋白质交联的定义、机制、生物学功能和研究进展等方面进行介绍和探讨。
一、DNA-蛋白质交联的定义和机制DNA-蛋白质交联是指DNA分子与蛋白质之间通过共价或非共价键结合的现象。
在细胞内，DNA-蛋白质交联是通过蛋白质与DNA双螺旋结构上的特定序列、特定结构区域相互结合而形成的。
蛋白质在不同的生物学过程中与DNA结合的方式有所不同，主要包括非特异性结合和特异性结合两种机制。
非特异性结合是指蛋白质与DNA上的任何位点都可以相互结合，通常是通过电荷间相互作用、疏水作用等方式实现的。
这种结合方式在染色体的包装中起到了重要的作用，如组蛋白与DNA的结合就是通过非特异性结合实现的。
DNA-蛋白质交联的形成是通过蛋白质的结构域（如DNA结合结构域、螺旋转录因子结构域、锌指结构域等）与DNA上的特定序列或特定结构区域之间的相互作用实现的，这种相互作用对于调控基因的表达、维持染色体的结构和稳定性、参与DNA修复和复制等生物学过程具有重要的意义。
对于DNA-蛋白质交联的研究不仅有助于深入理解细胞生物学过程，还对人类疾病的治疗和诊断具有潜在的应用价值。
DNA-蛋白质交联在细胞生物学过程中发挥着多种重要的生物学功能，主要包括以下几个方面：1. 调控基因的表达DNA-蛋白质交联通过调控基因的转录、剪接和翻译等环节，参与调控基因的表达。
许多转录因子与DNA结合后能够激活或抑制某些基因的转录，从而对基因的表达进行调控。
2. 维持染色体的结构和稳定性DNA-蛋白质交联通过调控染色体的组装和结构，维持染色体的稳定性和整体结构。
蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究方法加实例
蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
一.酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 二.免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) 三.GST pull-down 技术 四.荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h
1.5 酵母双杂交技术的弱点：
1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 2. 3. 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 1. 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 2. 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……
1.3 应用
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋
白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含 DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-
activating domain的载体。另外还需要特殊的酵
母菌株如GAL4缺陷型。
•
它可用于：
– – – 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
Ru(bpy)3 2+ -DNA体系的共振光散射光谱研究及其分析应用
院提供 ） 。
１２ 实验 方法 ．
与 Ｄ Ａ相互作用的共振光散射光谱 ， Ｎ 基于 Ｄ Ａ对 Ｎ Ｒ （ｐ） 的 共 振 光 散 射 的增 强 效 应 ，建 立 了共 ｕｂｙ
振 光 散 射 法 测 定 Ｄ Ａ 的 新 方 法 。该 方 法 简 便 快 Ｎ
在 １ 比色管 中加入 １０ ＬＢＲ缓 冲溶液 ０ｍ Ｅ ．０ｍ —
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公司产 品 ） 解 于 适 量 水 中 配 制 而 成 ，并 保 存 于 溶 ０～４ｏ冰箱 中 ，紫外 测 定 Ａ６ Ａ ＞１８ 其 准确 Ｃ ２／ 瑚 ０ ．， 浓度 由紫外 光 谱 中 ２０ｎ ６ ｌ 的 吸 光 度 确 定 （Ｏ ｎ处 ＩＤ
（Ｈ ３ ０ 和 １ ５ 浓 度 为 １０×１ Ｉ ｍ ｌ ｐ ．） ．０ ｍ Ｅ ． ０ ４ ｏ／ Ｌ的
捷， 具有较高的灵敏度和较 好的稳定性 ， 成功应 用 于合 成样 品及 实 际样 品 中 Ｄ Ａ的测 定 。 Ｎ
[学位论文]荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用
![[学位论文]荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用](https://img.taocdn.com/s3/m/9ea4d2a768dc5022aaea998fcc22bcd126ff4224.png)
摘要摘要蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子，研究蛋白质和核酸的相互作用，发展能对重要蛋白质进行实时检测的高灵敏度的分析方法是后基因组时期重要的研究领域之一。
本论文工作围绕发展荧光光谱法研究DNA/蛋白质相互作用性质机理以及利用DNA/蛋白质特异相互作用发展蛋白质检测新方法两个方面开展工作，论文的主要内容包括：1. 利用荧光各向异性法详细研究了DNA甲基化转移酶M.Eco R I与两种不同链长DNA的相互作用，得到不同温度下的结合常数和它们结合的热力学参数。
表明M.Eco R I与短链DNA的结合强于与长链DNA的结合。
M.Eco R I与靶向DNA的结合过程是熵驱动的。
为理解DNA和M.Eco R I相互作用机理和调控DNA和M.Eco R I的结合提供了新的信息。
2. 用荧光共振能量转移的方法研究了M.Eco R I与标记荧光给体和受体的DNA结合后诱导的DNA弯曲，在溶液中直接测得DNA的弯曲角度为57.8°。
3. 进一步探讨了在单分子水平研究M.Eco R I诱导DNA弯曲的实验方法和条件。
实现了单对荧光分子标记DNA的双波长同时成像，为利用单分子荧光共振能量转移研究DNA弯曲打下了基础。
4. 利用单链DNA核酸适体既可以与靶蛋白特异结合又能与互补寡聚核苷酸形成双链的特点，以α-凝血酶为模型体系，发展了一种基于核酸适体和DNA光开关配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+的蛋白质检测新方法，该方法具有灵敏度高、选择性高，无需对核酸适体进行荧光标记，适合于不同构象核酸适体等优点，对于促进核酸适体在生物分子的实时监测分析、生物传感器等方面的应用有重要意义。
关键词： DNA甲基化转移酶，DNA结合蛋白，DNA弯曲，核酸适体，光开关配合物，α-凝血酶I荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用AbstractBaocheng Ma( Physical Chemistry)Supervised by Prof. Xiaohong FangProtein and nucleic acid are two classes of important biomacromolecules in biological systems. The study of protein-nucleic acid interaction and the development of analytic methods with high sensitivity and specificity for real-time protein monitoring are of particularly interest in post-genomic era.In this dissertation, we have developed the fluorescence spectroscopic methods to study the DNA-protein interaction and to detect protein using novel DNA probes. The major results are shown as following:1. Fluorescence anisotropy has been applied to study the interaction between Eco RIDNA methyltransferase (M.Eco RI), and its two target DNA fragments in solution.Their binding constants at different temperatures from 20 to 40 ℃ were obtained and the thermodynamic parameters of binding were derived. The results showed M.Eco RI had higher binding affinity to the short dsDNA than that to the long one, and its binding to DNA was primarily entropy driven. This provides the new information for the understanding of the forces that drive M.Eco R I-DNA complex formation, and for research on the regulation and control of the interaction between DNA and M.Eco R I.2. The M.Eco R I binding induced distance change between the donor FAM and theacceptor TMR labeled at the tow ends of 20bp dsDNA containing GAATTC has been studied by fluorescence resonance energy transfer. The bending angle of DNA was measured directly in solution as 57.8°.3. The study of DNA bending by M.Eco R I binding at the single molecule level hasbeen further explored. Single molecule imaging of the dual labeled DNA immobilized on the coverslips has been achieved by total internal reflectionAbstractfluorescence microscopy equipped with a dual-view system. This provides the basis for the application of single-pair fluorescence resonance energy transfer to DNA bending study.4. Taking the advantage of the dual natural property of DNA aptamers that can notspecifically binds with target proteins but also form duplexes with their complementary oligonucletides, and the DNA light switching probe of [Ru(phen)2(dppz)]2+, we have developed a new label-free method for protein detection which can be used for the aptamer probes with different foldings. Using α-thrombin as a model protein, the results showed high sensitivity and specificity.The newly developed signaling strategy is expected to promote the exploitation and application of aptamers in biochemical and biomedical studies.Keywords: DNA methyltransferase, DNA binding protein, DNA bending, aptamer, light switching complex, α-thrombin.荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用目录摘要 (I)Abstract (III)第一章 引言 (1)第一节 DNA和蛋白质相互作用的研究方法 (1)第二节 荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用 (5)第三节 新型蛋白质探针—核酸适体的研究进展 (27)第四节 本论文的选题意义 (37)参考文献 (39)第二章 甲基化转移酶M.Eco R I和DNA结合的热力学性质研究 (56)2.1 引言 (56)2.2 实验部分 (58)2.3 结果与讨论 (61)2.4 小结 (68)参考文献 (69)第三章 荧光共振能量转移研究M.Eco R I所引起的DNA弯曲 (73)3.1. 引言 (73)3.2. 实验部分 (78)3.3. 结果与讨论 (79)3.4. 小结 (85)参考文献 (85)第四章 单分子荧光共振能量转移研究M.Eco R I所引起的DNA弯曲 (91)4.1. 引言 (91)4.2. 实验方法及数据处理 (91)4.3. 结果与讨论 (95)4.4. 小结 (101)参考文献 (102)第五章 基于核酸适体/互补DNA和光开关配合物检测蛋白质 (104)5.1 引言 (104)5.2 实验部分 (109)5.3 结果与讨论 (110)5.4 小结 (115)参考文献 (116)第六章 结论 (120)攻读博士期间发表的论文 (122)致谢 (123)第一章 引言生命科学是20世纪最重要的前沿领域之一，其重点在于了解各种生命活性物质的结构、功能及它们之间的相互关系。
共振光散射技术的原理与应用
Ｉ ． １共 振 光散 射技 术的原理
铬、 铅、 锡 是 无机 重 金属 元 素 ， 在测 定这 些 元 素时 ， 常 常使 当溶 液 中介质 的 直径 比入 射 光 波 大很 多时 ， 发 生 的 散 射 现 敏 度 。 象可 看 作光 波的反 射 和折 射 ； 当介质 的直径 与入 射光 波长 度 相等 用共 振 光散 射 技术 。
共振 光 散 射 技术 是 ～ 种可 以在普 通 荧 光分 光 光 度 计上 完 成 分 析测 定 的技 术 ， 它 操作 步骤 简单 ， 被 广泛 应用 于生 活 中的各 个
２ ． １ 共振 光散射技 术在 无机 元素分析 方面的应用
共振 光散射技 术在测定 溶液中的无机 元素时， 常 用 的 测
移 动 互 联 网
共 振 光 散射 技 术 的原理 与 应 用
唐卓雅 湖南广益实验 中学 摘要： 共振 光散射 技术 在近年来得到 了 迅速 的发展 ， 该种技 术快 速 、 简 便、 灵敏 ， 在一 台普通 荧光 分光光度计 即可完成分析。 本文分析 了 共振 光散 射技 术的原理与特点 ， 并从 无机 元素分析、 生化 分析、 纳米材料 分析 几个 方面分析 了 共振 光散射技 术 的应用。 关键 词 ： 共 振光散射技 术 原理 应 用
振 现 象， 但 这 时 光 的散 射强 度 较 低 ， 甚 至 比溶 液 的 散 射强 度 还 粒子对 荧光 素 吸 光度 的影 响也 不 尽相 同， 因而可 以在 此基 础上 ， 要低 １ ２级 ， 所 以在 这种 情况 下 ， 需要 利用 高 浓度 的有 机 染 料对 绘 制 出金 纳 米 粒子 浓 度与 吸 光 度 的关 系曲线 ， 从而 实 现 测定 金
电子 会跃 迁 至 电子激 发 态 这 可 以让 电子激 发 到一 定的 振 动能 级 。
DNA与蛋白质结合的共振光散射研究及应用
第 ５期
李艳坤 等 ： ＤＮＡ 与 蛋 白质 结 合 的共 振 光 散 射 研 究 及应 用
和 转 录等细胞 活 动ｌ ．蛋 白质 与 ＤＮＡ 相互作 用 非常 复杂 ， 白质一 】 ］ 蛋 ＤＮＡ 复合物 通过 蛋 白质 与 Ｄ ＮＡ 之 间 的
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｈ ｍ ｂ ｎ ｔｏ ｆ ＤＮＡ ｔ ｏ ｅ ｎ ｂ ｓ ｎ ｎｃ ｔ ｄ ｎ ｔ ｅ Ｃｏ ｉ ａ ｉｎ ｏ ｗｉｈ Ｐｒ ｔ ｉ ｙ Ｒｅ ｏ ａ ｅ
Ｌｉ ｈｔＳ ａ ｔ ｒ ｎｇ Ｔｅ ｈ ｑｕ ｎ ｔ ｇ ｃ ｔｅ ｉ ｃ ｎｉ ｅ ａ ｄ Ｉ ｓ Ａｎａ ｙ ｉ ａ ｐｌｃ ｔｏ ｌ ｔｃ ｌＡｐ ｉ ａ ｉ ｎ
２１ ０ １年 ９月
ＤＮＡ 与 蛋 白质 结 合 的共 振 光 散 射 研 究 及 应 用
李 艳 坤
（ 北 电 力 大 学 环 境 科 学 与 ２ 程 学 院 ，河 北 保 定 华 １ ２ ０ １０ ） ７ ０ ３
摘 要 ： ｐ ． １ ４ ３ 在 Ｈ ２ ２ ～ ． ５的 Ｂ ｉ ｏ — ｏ ｉｓｎ Ｂ 缓 冲 溶 液 中 ， 氧 核 糖 核 酸 （ ＮＡ） 蛋 白质 相 互 ｒ ｔｎＲ ｂｎ ｏ （ Ｒ） ｔ 脱 Ｄ 与
Ａ ｂ ｔ ａ ｔ Ｐｒ ｅ ｎ ｉ Ｎ Ａ ｏ ｆ ｒ ａ ｃ ｍ ｐｌ ｘ， ｗ ｈｉｈ ｉ ｂ ｇ ｒ ｔ ｎ ｓｒ ｃ ： ｏｔ ｉ ｓ ｂ ｎｄ Ｄ ｔ ｏ ｍ ｏ ｅ ｃ ｓ ｉ ｇｅ ｈａ ＤＮ Ａ ｒ ｐ ｏｔ ｉ ， ｌ ａ ｉ ｇ ｔ ｏ ｒ ｅｎｓ ｅ ｄ ｎ ｏ
第３ 卷 １
第 ５ 期
河北大 学 学报 （ 自然 科 学 版 ）
共振光散射技术在物理实验中的应用技巧
共振光散射技术在物理实验中的应用技巧光散射技术是物理学领域中常用的一种实验手段，它可以通过散射光的特征来研究物质的性质和结构。
其中，共振光散射技术是一种相对较为先进的手段，能够提供更加精确和详细的信息。
本文将探讨共振光散射技术在物理实验中的应用技巧，以及如何提高实验的可重复性和准确性。
首先，了解共振光散射技术的基本原理是十分重要的。
在物理实验中，通过调节光的入射角度和波长，可以使光与材料发生共振现象。
共振光散射技术主要包括共振散射光谱和共振散射图像两种形式。
共振散射光谱可用于分析物质的光学性质，如折射率、透射率等，而共振散射图像则能提供物质的微观结构和形貌信息。
在实验中，我们可以根据具体需要选择相应的测量方式。
其次，实验的准备工作也是非常重要的一环。
在进行共振光散射实验之前，首先需要准备好实验器材和样品。
例如，我们需要一个高质量的激光器，用于产生高强度的入射光束。
同时，样品的制备也至关重要。
样品应准确地制备成所需的形状和规格，以确保实验结果的准确性。
在实际操作中，还需要注意实验环境的稳定性和干净度，避免可能的外界干扰对实验结果的影响。
在实验过程中，合理地选择测量条件可以显著提高实验结果的可靠性。
一般情况下，我们会通过调节入射角度和波长来实现共振现象。
入射角度的选择需要尽可能接近物质的布拉格散射条件，以增强散射信号的强度。
而波长的选择则要根据所研究物质的性质和结构来决定。
不同波长的光在物质中的散射行为各异，通过选择合适的波长，我们可以获得更加丰富的信息。
另外，数据的处理和分析也是实验中不可忽视的环节。
共振光散射实验所获得的数据需要经过合理处理，才能得到准确的结果。
常用的数据处理方法包括背景校正、噪声滤除、数据拟合等。
通过这些处理手段，可以提高数据的可信度和准确性。
在数据分析过程中，还要充分利用已有的理论模型和计算方法，与实验结果进行对比和验证。
为了进一步提高实验结果的可重复性和准确性，我们还可以尝试一些实验技巧和改进措施。
研究蛋白质与DNA相互作用
一、凝胶阻滞试验1.试验原理又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。
如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
2.主要步骤及内容首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。
将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。
应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。
如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。
凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。
其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。
如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。
相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。
在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。
蛋白质与dna的相互作用
磷酸化对细胞信号转导的影响
03
蛋白质磷酸化可以参与细胞信号转导过程，通过磷酸化作用将
信号传递给下游的蛋白质，进而影响基因的表达和转录。
小分子化合物对蛋白质与DNA相互作用的调节
小分子化合物
小分子化合物是一种可以与生物大分子结合并调节其功能的化合物。
小分子化合物对蛋白质与DNA相互作用的调节
小分子化合物可以与蛋白质或DNA结合，影响其结构和功能，进而调节蛋白质与DNA的 相互作用。
通过检测蛋白质与DNA相互作用的变化，可以早期发现肿瘤 等疾病，提高疾病诊断的准确性和及时性。
开发新型药物
针对蛋白质与DNA相互作用的药物设计，可以开发出更高效 、低毒的药物，用于治疗肿瘤、遗传性疾病等。
在药物设计和开发中的应用
靶点筛选
通过研究蛋白质与DNA相互作用，可 以筛选出潜在的药物靶点，为新药研 发提供新的思路和方法。
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核糖体
核糖体是负责蛋白质合成的细胞 器，通过与mRNA结合，翻译出
相应的蛋白质。
翻译因子
翻译因子是一组能够促进核糖体在 mRNA上移动的蛋白质，确保翻译 过程的顺利进行。
蛋白质修饰
蛋白质修饰是指对已经合成的蛋白 质进行化学修饰的过程，如磷酸化、 乙酰化等，可以调控蛋白质的活性 和功能。
DNA损伤修复
DNA修复酶
DNA修复酶是一组能够 识别和修复DNA损伤的 蛋白质，如碱基切除修 复酶、DNA聚合酶等。
DNA损伤感应器
DNA损伤感应器是一组 能够检测到DNA损伤的 蛋白质，如ATM激酶、 PAR激酶等。
DNA重组蛋白
DNA重组蛋白是一组能 够参与DNA重组过程的 蛋白质，如重组激活基 因蛋白、重组连接蛋白 等。
共振光散射法在核酸测定中的应用研究
内 容 摘 要 ：本 文 用Ｒ Ｓ 术研 究 了在 酸性介 质 中 ，阳 离子 表 面活性 剂 溴化十 六烷 基三 甲铵 Ｌ技
（ ＭＡ 存 在 下 ， 来铬 蓝黑 Ｒ（ ｒ ｃ ｒ ｍｅ ｌｅ ｌ ｋＲ， Ｂ Ｒ） 鱼 精 脱 氧核 糖 核 酸 （ ＤＮＡ） 互 作 ＣＴ Ｂ） 依 Ｅ ｉ ｈｏ ｕ ａ Ｅ Ｂ 与 ｏ Ｂ Ｂ ｃ ｆ ｓ 相 用 的 Ｒ Ｓ 谱 特 征 及 影 响 因 素 ， 并 在 优 化 实 验 条 件 下 ， 实现 了对 ｆ Ｌ 光 ｓ ＤＮＡ的 定 量 检 测 。 对 于 Ｅ Ｂ Ｂ Ｒ
２３ Ｌ ． ｍ 冰醋酸＋ ． 硼酸 ） ． ｍ ｌ ａ Ｈ ６ ２ ０ｇ ４ 和０ ｏ ＬＮ Ｏ 按所需ｐ 值混合配制而成 。Ｎ Ｃ储备液 ：． ｍ ｌ ２ ／ Ｈ ａｌ ０１ ｏ ／ Ｌ 实验 中所用 试 剂 为 分析 纯 ， 验 用 水 为二 次 水 。 。 实
（ ） 二 实验 方 法 。
ＣＴＭＡＢ—ｆ ｓ ＤＮＡ体 系 ， ＤＮＡ浓度 的线 性 范 围为００ ￣１６ｔｇ ｍＬ， 应 的检 出 限 （ 叮， ｆ ｓ ．１ ． ／ ｘ 相 ３ ｎ＝ ５ 为４６ｎ ／ 。 ） ． ｇ ｍＬ
将 所 建 立的 方 法 用 于 合成 样 品 中痕 量 核 酸 的 测 定 ， 收 率 在９ ％一 ０ ％之 间 ， Ｄ小 于２８ 回 ７ １６ ＲＳ ． ％。
共 振 光散 射 法 在 核 酸 测 定 中 的应 用 研 究
一
、
实验 部 分
（ ） 验 与仪 器 。 一 实
Ｆ ２ ０ 型荧光分光光度计 （ 一 ５０ 日本 日立公司 ）Ｑ 一 ０ 型旋 涡混合器 （ 门市其林贝尔器材制 ，Ｌ ９ １ 海
DNA-蛋白质交联的研究进展
DNA-蛋白质交联的研究进展DNA-蛋白质交联是一种重要的细胞分子结构，它在细胞内起着非常重要的功能。
过去，科学家们对DNA-蛋白质交联的研究工作不多，但随着科学技术的不断发展，对DNA-蛋白质交联的研究已经取得了很大的进展。
本文将介绍一些关于DNA-蛋白质交联的研究进展，并探讨其在生物学、医学和生物工程等领域的应用前景。
DNA-蛋白质交联是指DNA和蛋白质之间通过共价键结合在一起的化合物。
在细胞内，DNA-蛋白质交联扮演着很多重要的角色，包括调控基因表达、维持染色体结构、修复DNA损伤等。
对DNA-蛋白质交联的研究不仅有助于理解细胞内的生命活动，也有助于开发新的药物和治疗方法。
近年来，研究人员发现DNA-蛋白质交联与癌症的发生和发展密切相关。
一些致癌物质如烟草中的多环芳烃和化学物质中的胺类化合物都可以与DNA结合形成DNA-蛋白质交联，导致DNA损伤和基因突变，从而引发癌症。
对DNA-蛋白质交联的研究不仅有助于揭示癌症的致病机制，也有助于开发新的预防和治疗癌症的方法。
DNA-蛋白质交联还在生物工程和生物医学领域有着广泛的应用前景。
在基因工程中，科学家们可以利用DNA-蛋白质交联技术将外源基因导入宿主细胞中，从而实现基因的定向修饰和转染。
在药物研发中，可以利用DNA-蛋白质交联技术对药物与靶标蛋白质之间的相互作用进行研究，从而筛选和开发新的药物。
近年来，随着高通量测序技术和质谱技术的快速发展，对DNA-蛋白质交联的研究也取得了很大的进展。
研究人员可以利用这些技术高效地识别和定量分析DNA-蛋白质交联的形成和分布，揭示其在细胞内的功能和作用机制。
研究人员还可以利用这些技术对DNA-蛋白质交联的临床应用进行研究，为疾病诊断和治疗提供新的思路和方法。
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第３１卷 第５期２０１１年 ９月河北大学学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．５Ｓｅｐ．２０１１ＤＮＡ与蛋白质结合的共振光散射研究及应用李艳坤（华北电力大学环境科学与工程学院，河北保定 ０７１００３） 摘 要：在ｐＨ ２．２１～４．３５的Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ＢＲ）缓冲溶液中，脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）与蛋白质相互作用形成复合物，引起较ＤＮＡ或蛋白质单独存在时的共振光散射（ＲＬＳ）信号的强烈增强．用于分析蛋白质与ＤＮＡ结合的相互作用．实验结果显示：ＤＮＡ与蛋白质之间存在较强的静电相互作用．在最佳实验条件下，波长３１５．０ｎｍ处，ＲＬＳ强度的增强与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）在０．０５～１．３μｇ／ｍＬ呈良好的线性关系，检出限达到纳克级．该方法不需要任何特殊试剂，快速简便，建立了蛋白质检测分析的新方法，可用于人血清实际样品的测定．关键词：共振光散射；蛋白质；脱氧核糖核酸；相互作用中图分类号：Ｏ ６５７．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００－１５６５（２０１１）０５－０５０２－０６Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＲｅｓｏｎａｎｃｅＬｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＬＩ Ｙａｎ－ｋｕｎ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ＰｏｗｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄ ＤＮＡ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｂｉｇｇｅｒ ｔｈａｎ ＤＮＡ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏｓｔｒｏｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＲＬＳ）ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｉｓ，ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｔｒｏｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＲＬＳ）ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ａ Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂ－ｉｎｓｏｎ（ＢＲ）ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ２．２１－４．３５）．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇｆｏｒｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ＤＮＡ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＲＬＳ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｔ ３１５．０ｎｍｗａｓ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＳＡ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０５－１．３μｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆｏｒ ＢＳＡ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｔ ｎａｎｏｇｒａｍ ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｄｏｅｓｎ ｔ ｎｅｅｄ ａｎｙ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｎｅｗ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｃｔｕａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ；ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ蛋白质、核酸是生物大分子的代表，是生物化学研究的重要对象．蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要组成部分，也是分子生物学研究的中心问题之一．蛋白质参与ＤＮＡ的复制、重组、病毒整合 收稿日期：２０１０－１１－２０ 基金项目：河北省自然科学基金资助项目（Ｂ２０１１５０２０６１）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（０９ＱＬ５２） 第一作者：李艳坤（１９７７－），女，河北大名人，华北电力大学讲师，博士，主要从事光谱分析研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙｋ８００＠ｔｏｍ．ｃｏｍ第５期李艳坤等：ＤＮＡ与蛋白质结合的共振光散射研究及应用和转录等细胞活动［１］．蛋白质与ＤＮＡ相互作用非常复杂，蛋白质－ＤＮＡ复合物通过蛋白质与ＤＮＡ之间的特异性和非特异性相互作用形成．目前除了凝胶迁移（ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅⅠ足迹法（ＤＮａｓｅⅠｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ）、免疫沉淀法（ＣｈＩＰ）、酵母单杂交技术［２－４］等经典方法，还包括原子力显微镜（ＡＦＭ）、表面等离子共振（ＳＰＲ）、生物质谱技术、指数富集配体系统进化法（Ｓｅｌｅｘ）［５－６］等新兴方法，在阐明蛋白质结合ＤＮＡ形成的复合物的结构上已经取得不少进展．但这些方法大都存在操作步骤复杂、实验条件要求严格、实验成本高等缺点．共振光散射（ＲＬＳ）分析方法是一种能在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射分析技术，在研究生物大分子识别、组装和聚集时出现灵敏而丰富的信号，可取得与常用的荧光法同样高的灵敏度．共振光散射分析方法不仅可用于生物大分子的定量检测，而且可用于生物大分子间、生物大分子与其他物质之间相互作用机理的研究［７］．有关蛋白质和核酸种类及其含量的测定在生命科学和医药领域中也有着重大的意义和广泛的应用．ＤＮＡ与蛋白质相结合，形成ＤＮＡ－蛋白质复合物，较ＤＮＡ或蛋白质的体积增大，引起光散射信号的强烈增强．目前，共振光散射用于分析ＤＮＡ－蛋白质复合物方面的文章尚未见报道．本文利用共振光散射技术研究ＤＮＡ与蛋白质的相互作用，并由此建立了操作简便、灵敏度高的蛋白质检测分析的新方法．１ 实验部分１．１ 仪器和试剂Ｆ－４５００荧光分光光度计（日本日立公司）；ＷＨ－８６１型旋涡混合器（江苏太仓市科教器材厂）；ｐＨ酸度计（Ｓ－３Ｃ，上海伟业仪器厂）；ＤＮＡ贮备液：准确称量小牛胸腺ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ，Ｓｉｇｍａ Ｄ－１５０１），直接溶于水配成１００μｇ／ｍＬ的溶液，并于０～４℃冰箱中保存；ＢＳＡ贮备液：准确称取牛血清白蛋白（ＢＳＡ），直接溶于水中配成１００μｇ／ｍＬ的溶液，并于０～４℃冰箱中保存；Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ＢＲ）缓冲溶液用于控制溶液的酸度；ＮａＣｌ储备液：０．５ｍｏｌ／Ｌ．所用试剂均为分析纯，所用的蒸馏水全部为二次蒸馏水．１．２ 实验方法在１０ｍＬ比色管中，依次加入０．７ｍＬ １０μｇ／ｍＬ的ｃｔＤＮＡ溶液，０．５ｍＬ的ＢＲ缓冲溶液（ｐＨ＝３．７８），适量的标准ＢＳＡ溶液，每加一种试剂都将体系旋涡混合．最后将试液用二次蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后于荧光分光光度计上进行同步扫描（λｅｘ＝λｅｍ），获得共振光散射（ＲＬＳ）光谱，并在３１５．０ｎｍ处测定ＲＬＳ强度．激发和发射狭缝宽度均为５ｎｍ，负高压为４００Ｖ．２ 结果与讨论２．１ 散射光谱ｃｔＤＮＡ（Ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ ＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ），ＢＳＡ－ｃｔＤＮＡ的ＲＬＳ光谱如图１所示．ＤＮＡ，ＢＳＡ的水溶液属于高分子均相溶液，其散射应属于瑞利散射．根据瑞利散射定律（ｒａｙｌｅｉｇｈ ｌａｗ），在校正仪器特性的影响下，散射光的强度与波长λ的四次方成反比．其溶液的散射是由于它们的浓度涨落引起的，由于ＤＮＡ，ＢＳＡ单独存在时，浓度很低，瑞利散射强度太弱，根本不能用作分析测定．但是当ＤＮＡ与ＢＳＡ处于同一溶液体系中时，两者发生相互作用，形成体积较大的复合体，此时产生强烈的共振光散射现象．因为根据共振光散射理论，粒子体积的增大和强静电结合及大结合数所导致的高度的电子离域共轭，都会产生强烈的共振光散射现象．所以，从图１可以看出，在ｐＨ ３．７８的ＢＲ缓冲溶液中，波长２５０～７００ｎｍ，ＢＳＡ－ＤＮＡ复合物的ＲＬＳ信号比ＤＮＡ的ＲＬＳ信号有明显的增强，并在接近ＤＮＡ分子吸收谱带附近３１５．０ｎｍ处产生最大ＲＬＳ峰．而且ＲＬＳ强度随ＢＳＡ浓度的增大而增强，并在一定范围内呈线性关系．２．２ ＢＳＡ和ＤＮＡ的相互作用根据目前各种对蛋白质与ＤＮＡ结合的复合物的研究，蛋白质与ＤＮＡ形成复合物时能使ＤＮＡ分子发生扭曲、拉伸而变形，从而使蛋白质更紧密地与ＤＮＡ接触［８］．ＤＮＡ碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的氨基或亚氨基相互交联在一起，在几分钟内形成生物复合体（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）［９］．在ＤＮＡ与蛋白质复杂的特异性和非特异性相互作用中，蛋白质的氨基末端和ＤＮＡ主链骨架上带负电的磷酸基（ＰＯ２２－）产生静电相互作用，提供结合能，有利于ＤＮＡ－蛋白质复合物的稳定［１０］；此外，还发现蛋白质的氨基末端和ＤＮＡ嘌呤·３０５·河北大学学报（自然科学版）２０１１年碱基之间有氢键存在．本文考察了溶液处于不同ｐＨ时，ＢＳＡ与ＤＮＡ作用的ＲＬＳ强度，结果如图２所示．可以看出，在大约ｐＨ＜４．７的酸性范围内，ＢＳＡ在ｃｔＤＮＡ存在下产生很强的ＲＬＳ信号．由此证明了ＢＳＡ与ＤＮＡ之间存在的静电相互作用．因为蛋白质的等电点接近ｐＨ ４．７，在ｐＨ＜４．７时带有正电荷，而核酸表面的磷酸基带有负电荷，所以二者可以结合形成复合体从而产生较强的ＲＬＳ信号；而当ｐＨ＞４．７时，蛋白质带负电荷，二者之间的静电作用减弱，ＲＬＳ信号急剧降低．当ｐＨ值为３．７８时，ＢＳＡ的ＲＬＳ信号增强最大，选定为实验最佳ｐＨ值．同时通过向体系中加入不同浓度的ＮａＣｌ溶液，考察了离子强度对ＤＮＡ－ＢＳＡ相互作用的影响．在１０ｍＬ比色管中，使ＤＮＡ质量浓度为０．７μｇ／ｍＬ，ＢＳＡ质量浓度为１．０μｇ／ｍＬ，ＢＲ（ｐＨ ３．７８）缓冲溶液０．５ｍＬ，然后分别加入ＮａＣｌ溶液，使稀释后的ＮａＣｌ溶液的最终浓度分别为０．００１，０．０１，０．１ｍｏｌ／Ｌ．经考察后发现，溶液中ＮａＣｌ为０．００１，０．０１ｍｏｌ／Ｌ时，体系的ＲＬＳ强度基本不变．然而当ＮａＣｌ为０．１ｍｏｌ／Ｌ时，体系的ＲＬＳ强度急剧降低了２２％；ＤＮＡ－ＢＳＡ复合物在高的离子强度下遭到破坏，表明了在ＤＮＡ与蛋白质各种复杂的相互作用中，蛋白质的氨基酸残基和ＤＮＡ磷酸基团发生的静电相互作用是主要因素．１．ｃｔＤＮＡ；２～４．ＢＳＡ－ｃｔＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ（μｇ／ｍＬ）：０．７；ＢＳＡ（μｇ／ｍＬ）：２．０．０５；３．０．２；４．０．５；ｐＨ＝３．７８．图１ 共振光散射谱Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｏｎａｃｅ ｌｉｇｈｔ－ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａ１．ｃｔＤＮＡ；２．ＢＳＡ－ｃｔＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ（μｇ／ｍＬ）：０．７；ＢＳＡ（μｇ／ｍＬ）：１．０．图２ 不同ｐＨ下ＢＳＡ－ＤＮＡ的ＲＬＳ强度Ｆｉｇ．２ ＲＬＳ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＢＳＡ－ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ２．３ 基于ＤＮＡ与蛋白质结合的蛋白质分析方法２．３．１ ＤＮＡ质量浓度的影响在ｐＨ ３．７８的ＢＲ缓冲溶液中，保持ＢＳＡ的质量浓度１．０μｇ／ｍＬ不变，ｃｔＤＮＡ质量浓度变化与ＲＬＳ强度的变化特征如图３所示．可以看出，最初随着ｃｔＤＮＡ质量浓度的增大，ＲＬＳ强度逐渐增强；当ｃｔＤＮＡ质量浓度大于０．７μｇ／ｍＬ后，随着ｃｔＤＮＡ质量浓度的增大，ＲＬＳ强度反而逐渐减小．根据对ＤＮＡ凝聚的理论研究［１１－１２］，在此ＤＮＡ与蛋白质的相互作用应该经历２个阶段：首先，ＤＮＡ与蛋白质结合形成大的凝聚体，蛋白质的氨基和ＤＮＡ的磷酸基之间的静电作用，促使ＤＮＡ－蛋白质复合物的稳定；当２者达到一定的化学结合计量比后，随着ＤＮＡ质量浓度的增大，ＤＮＡ－蛋白质复合物链开始结合另一条ＤＮＡ链，ＤＮＡ表面的磷酸基所带电荷逐渐被中和而变为电中性，导致ＤＮＡ从溶液中沉淀出来，所以ＲＬＳ强度逐渐减小．ｃｔＤＮＡ质量浓度为０．７μｇ／ｍＬ时，ＲＬＳ强度达到最大值．所以选择０．７μｇ／ｍＬ的ｃｔＤＮＡ质量浓度为测定蛋白质含量的最佳浓度．２．３．２ ＢＲ缓冲溶液用量的影响在体系中分别加入ＢＲ缓冲溶液（ｐＨ ３．７８）０．２５，０．５，１．０，１．５，２．０ｍＬ，考察ＢＲ缓冲溶液用量对ＲＬＳ强度的影响，结果如图４所示．可以看出，当ＢＲ缓冲溶液用量小于１．５ｍＬ时，ｃｔＤＮＡ的ＲＬＳ强度随ＢＲ缓冲溶液用量的增加而增强，ｃｔＤＮＡ－ＢＳＡ的ＲＬＳ强度基本不变；当ＢＲ缓冲溶液用量大于１．５ｍＬ·４０５·第５期李艳坤等：ＤＮＡ与蛋白质结合的共振光散射研究及应用时，由于溶液中离子强度的增大，ＢＳＡ与ＤＮＡ表面的磷酸基之间的静电作用减弱，所以ＲＬＳ强度减弱．当加入０．５ｍＬ ＢＲ缓冲溶液时，ｃｔＤＮＡ－ＢＳＡ的ＲＬＳ信号增强最大，所以选择在１０ｍＬ比色管中加入ＢＲ缓冲溶液０．５ｍＬ．１．ｃｔＤＮＡ；２．ＢＳＡ－ｃｔＤＮＡ；ＢＳＡ（μｇ／ｍＬ）：１．０；ｐＨ＝３．７８．图３ 不同ＤＮＡ质量浓度下ＢＳＡ－ＤＮＡ的ＲＬＳ强度Ｆｉｇ．３ ＲＬＳ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＢＳＡ－ＤＮＡ ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ１．ｃｔＤＮＡ；２．ＢＳＡ－ｃｔＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ（μｇ／ｍＬ）：０．７；ＢＳＡ（μｇ／ｍＬ）：１．０；ｐＨ＝３．７８．图４ 不同体积ＢＲ溶液下ＢＳＡ－ＤＮＡ的ＲＬＳ强度Ｆｉｇ．４ ＲＬＳ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＢＳＡ－ＤＮＡ ｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｆ ＢＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２．３．３ 光谱稳定性在最佳实验条件下，ｃｔＤＮＡ与ＢＳＡ混合后立即进行测定．发现１ｈ内，ＲＬＳ强度随时间增大．１ｈ后，ＲＬＳ强度趋于稳定不变．所以实验中将混匀后的待测液放置１ｈ后进行测定．２．３．４ 标准曲线与检出限在以上确定的最佳实验条件下，按照实验方法，研究了ＢＳＡ的质量浓度与增强的ＲＬＳ信号（ΔＩ）之间的关系，并绘制了标准曲线，如图５所示．结果表明，ＢＳＡ在０．０５～１．３μｇ／ｍＬ有良好的线性关系，线性回归方程为ΔＩ＝－１．９２＋８２．７ρ，线性相关系数为０．９９９０，检出限为１１．０ｎｇ／ｍＬ，表明该方法具有很高的灵敏度．图５ 不同ＢＳＡ质量浓度与增强的ＲＬＳ信号关系Ｆｉｇ．５ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＳＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＲＬＳ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ·５０５·河北大学学报（自然科学版）２０１１年２．３．５ 干扰测定考察了常见的金属离子和氨基酸对测定１．０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ的干扰情况，结果列于表１．从表１数据可以看出，ＤＬ－苏氨酸和Ｌ－谷氨酸干扰较大．即使如此，它们的允许浓度也高于在生物体内的浓度．其他氨基酸和金属离子的干扰较小．所以，ＲＬＳ方法用于ＢＳＡ的分析测定，其他共存物质的干扰很小，表明该方法具有很好的选择性．表１ 共存物质的干扰Ｔａｂ．１ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｃｔＤＮＡ（ｍＬ）∶０．７；ＢＲ∶０．５ｍＬ；ｐＨ＝３．７８；λ＝３１５．０ｎｍ，表中数据为重复３次测量结果的平均值．２．３．６ 不同蛋白质的响应差别在最佳实验条件下，测定了１．０μｇ／ｍＬ的不同蛋白质的ＲＬＳ信号，并与相同实验条件下ＢＳＡ的ＲＬＳ值进行比较，结果列于表２．由表２可知，各蛋白质响应信号的大小基本符合它们相对分子质量大小的顺序，也就是说该分析方法的响应信号主要取决于蛋白质体积的大小，这与共振光散射理论是相符合的．表２ 不同蛋白质的响应值Ｔａｂ．２ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ蛋白质ＩＲＬＳ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）８５ 人血清白蛋白（ＨＳＡ）１１８ 胰岛素（Ｉｎｓｕｌｉｎ）１１．４ 明胶（Ｇｅｌａｔｉｎ）２３．６５鸡蛋白（Ｅｇｇ－ａｌｂｕｍｉｎ）６３．８８γ－球蛋白（γ－Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）１２０ ２．３．７ 人血清试样中总蛋白含量的测定用新鲜的人血清样品（由河北农业大学医院提供）经稀释后，同时用ＲＬＳ方法和考马斯亮蓝法（ＣＢＢ Ｇ－２５０）进行测定，结果列于表３．从ＲＬＳ方法分别对２个样品重复３次测量结果的平均回收率和相对标准偏差（ＲＳＤ）可以看出，ＲＬＳ分析方法准确可靠，可用于实际样品的测定．表３ 人血清样本中蛋白含量检测Ｔａｂ．３ Ａｓｓａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ样本序号考马斯亮蓝法ρ／（ｇ·Ｌ－１）共振光散射法ρ／（ｇ·Ｌ－１）回收率／％ＲＳＤ／％（ｎ＝３）１ ５６．８ ５６．０ ９８．６ ２．０２ ６２．０ ５８．４ ９４．２ １．７·６０５·第５期李艳坤等：ＤＮＡ与蛋白质结合的共振光散射研究及应用３ 结论基于蛋白质与ＤＮＡ相互作用形成复合物引起共振光散射信号增强的现象，对蛋白质与ＤＮＡ之间较强的相互作用进行了研究，并通过对牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的定量检测，建立了操作简便、灵敏度高的蛋白质检测分析的新方法，用于人血清实际样品的测定取得好的效果．参 考 文 献：［１］ＢＩＡＮＣＯ Ｐ Ｒ，ＴＲＡＣＹ Ｒ Ｂ，ＫＯＷＡＬＣＺＹＫＯＷＳＫＩ Ｓ Ｃ．ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ，１９９８，３：５７０－６０３．［２］ＫＷＯＮ Ｊ Ａ，ＲＨＯ Ｈ Ｍ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐ５３ｇｅｎｅ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒａｌ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＢｃ）ｉｎ ｈｕ－ｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３，３８４：２０３－２１２．［３］ＰＡＳＱＵＡＬＩＮＩ Ｒ，ＲＵＯＳＬＡＨＴＩ Ｅ．Ｏｒｇａｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８０：３６４－３６６．［４］ＬＩ Ｊ Ｊ，ＨＥＲＳＫＯＷＩＴＺ Ｉ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＲＣ６，ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ ａ ｏｎｅ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２：１８７０－１８７３．［５］ＨＯＹＴ Ｐ Ｒ，ＤＯＫＴＹＣＺ Ｍ Ｊ，ＷＡＲＭＡＣＫ Ｒ Ｊ．Ｓｐｉｎ－ｃｏｌｕｍｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｍｉｘｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ＡＦＭ ｉｍａｇｉｎｇ［Ｊ］．Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，２００１，８６：１３９－１４３．［６］ＷＥＮ Ｊ Ｄ，ＧＲＡＹ Ｃ Ｗ，ＧＲＡＹ Ｄ Ｍ．ＳＥＬＥＸ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｆｆ ｇｅｎｅ ５ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０（３１）：９３００－９３１０．［７］王甫丽，郝英霞，张红蕾，等．苯酚磺酞类酸性染料与蛋白质包合物的共振散射光谱［Ｊ］．河北大学学报：自然科学版，２００２，２２（１）：３２－３５．［８］ＬＩＵ Ｙｕｙｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｐｅｎｇｙｅ，ＤＯＵ Ｓｈｕｏｘｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｉｏｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｍｂｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅｉｒ ｆｏｒｃｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｌｔｉｎｇ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ，２００４，１２１：４３０２－４３０９．［９］王春雨，石建党，朱彦，等．染色质免疫沉淀技术在研究ＤＮＡ与蛋白质相互作用中的应用［Ｊ］．遗传，２００５，２７（５０）：８０１－８０７．［１０］皮新春，邹国林．限制性核酸内切酶与ＤＮＡ相互作用研究进展［Ｊ］．氨基酸和生物资源，１９９７，１９（２）：４４－４８．［１１］李正平，李艳坤，王愈聪，等．以六氨合钴（Ⅲ）为探针的ＤＮＡ共振光散射分析［Ｊ］．河北大学学报：自然科学版，２００４，２４（６）：６１１－６１４．［１２］刘玉颖，王鹏业，窦硕星，等．利用荧光偏振研究二价金属离子对ＤＮＡ与组蛋白结合的影响［Ｊ］．科学通报，２００６，５１（２３）：２７１９－２７２３．（责任编辑：梁俊红）·７０５·。