天蚕素 A - 蛙皮素杂合肽基因突变体的构建及其表达

天蚕素 A - 蛙皮素杂合肽基因突变体的构建及其表达1冯惟萍，韩跃武**，任慧子，陈建国兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所，兰州（730000）E-mail：fengwp@摘要：目的：用PCR定点突变法构建天蚕素 A(1～8)- 蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽( CA-MA 杂合肽)突变体,并在大肠杆菌中融和表达。

方法 采用 PCR 体外定点突变技术,设计一对方向相反的引物,其中一个引物引入突变点,应用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行重组表达质粒 pGEX-4T-1-CA-MA 的 PCR 扩增,使 CA-MA 杂合肽第 16 位密码子由AGT 变为 TGG ,将扩增片段自身连接，构建 CA-MA 杂合肽突变重组表达质粒,克隆入工程菌 E.coli BL21 中表达其突变肽 W16-CA-MA。

结果 DNA 测序结果表明在预期位点发生突变,突变体在大肠杆菌中高效表达。

结论 获得突变肽 W16-CA-MA，该基因的成功表达为进一步研究其抗病毒活性、抗病毒机理及结构-功能研究打下基础。

关键词：天蚕素A-蛙皮素杂合肽，聚合酶链反应，定点突变，融和表达0引言天蚕素 A (1～8) - 蛙皮素(1～12) 杂合基因抗菌肽为天然抗菌肽 Cecropin A 第1～8 位氨基酸与蛙皮素第1～12 位氨基酸融合的抗菌肽片段,它既保持了天蚕素 A 的广谱抗菌活性，而且获得了蛙皮素的抗微生物活性[1]。

CA-MA 杂合肽与其亲代肽比较,抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。

国外有学者以 CA-MA 杂合肽作为模版肽设计了几种类似物，发现在抑制病毒-细胞融合方面，这几种类似物的抗病毒活性均明显高于 CA-MA 杂合肽[2]。

目前的研究均是用人工合成肽的方法来改造抗菌肽的结构以达到增强抗微生物的作用,但人工合成的方法成本过高。

本文通过 PCR 体外定点突变技术成功构建突变体,并将其在大肠杆菌中融和表达[3]。

1 材料与方法1.1 材料1. 1. 1 质粒与菌株CA-MA 杂合肽重组原核表达质粒 pGEX-4T-1-CA-MA 由本室构建。

工程菌E.coliBL21由本室保存。

1. 1. 2 主要生化试剂TaKaRa MutantBEST Kit 、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司。

IPTG 购自 Promega 公司。

DNA Marker 、低分子量标准蛋白质 Marker 购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法1. 2. 1 PCR 引物设计按照突变引物设计原理,根据 CA-MA 杂合肽基因序列设计一对方向相反的引物Primer 1 和Primer 2 , ,并利用 Primer Premier 5 引物设计软件对引物进行分析,确保引物内本课题得到国家“863”计划资助项目(2006AA10A208-1-4 )的资助。

无发夹结构,引物间无二聚体形成,引物与模板其它部位无特异性结合。

然后送交上海生工生物工程公司合成。

Primer 1 引入突变位点,即 CA-MA 第 16 位氨基酸密码由 AGT 突变为 TGG 。

引物分别是Primer 1 : 5' -TTACACTGGGCAAAGAAGTTCGTCG-3'; Primer 2 ：5'-GAACTTGCCTATGCCT ATCTTCTTGA-3'。

1. 2. 2 PCR 扩增按照 PCR 体外定点突变法[4,5],用携带突变碱基的引物 Primer 1 和 Primer 2 以CA-MA 杂合肽重组表达载体为模板进行扩增,反应成分为: Polybest DNA polymeraseⅡ µL ；dNTP Mixture(各2.5mM) , 4 µL ; Primer 1 (5U/µL)，0.25 µL；10×Polybest buffer ,5(20µM) 和Primer 2 (20µM) 各 1 µL ；pGEX-4T-1-CA-MA（1ng/µL）, 1µL; 加 ddH2O 至50µL 。

扩增条件为: 94 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec ，72 ℃ 5 min ，共进行 30 次循环,末次循环后置 72 ℃延伸 10 min。

取 PCR 产物100 µL ,做 1 % 琼脂糖凝胶电泳后,切取 5 kb 左右片段进行胶回收。

1. 2. 3 Blunting Kination 反应DNA 片段5 µL , 10× Blunting Kination buffer 2µL, Blunting Kination Enzyme Mix1µL , 加 ddH2O 至 20µL ,37 ℃ 10min。

将反应液用酚-氯仿抽提后乙醇沉淀。

再用高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接(环化反应)。

1. 2. 4 CA-MA 突变体的构建、内切酶鉴定及测序将自身连接后的突变重组质粒 pGEX-4T-1- W16-CA-MA 转化入E.coli BL21感受态细胞中。

抽提突变体质粒,将抽提的突变体质粒用 PCR 、内切酶分析和测序加以鉴定，1. 2. 5 W16-CA-MA 突变蛋白的融合表达[3,6]重组质粒转化E.coli BL21，用 IPTG 诱导表达目的蛋白,全菌电泳鉴定。

W16-CA-MA基因为60bp ，GST 分子量约为 26KD，故表达融合蛋白分子量约为 30KD。

诱导表达后阳性条带位置与预期分子量位置相符，而未经 IPTG 诱导的细菌总蛋白在此位置没有明显的蛋白条带出现。

2结果2. 1 PCR 扩增、质粒克隆和突变蛋白的表达2. 1. 1 pGEX-4T-1-CA-MA 突变 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳将 1.2.2 中 PCR 扩增产物行1% 琼脂糖凝胶电泳, 扩增产物在 5000 bp 附近出现单一条带, 符合预期目的基因片段大小(Fig. 1)。

2. 1. 2 突变质粒克隆自身连接转化后的质粒经抗氨苄青霉素筛选，获得阳性菌落，抽提突变质粒,做质粒酶切及 PCR 鉴定。

将 1.2.4 中抽提的突变体质粒及双酶切后的突变体质粒行 1% 琼脂糖凝胶电泳。

突变体质粒出现三条带，为超螺旋、线状、以及半开环三种不同状态，双酶切后的突变体质粒在 5000 bp 附近出现单一条带, 二者均符合预期目的基因片段大小。

（Fig. 2）。

Fig.1 突变 PCR 产物电泳Fig.2 突变质粒抽提及酶切电泳M: 15 000 bp DNA Marker M: 15 000 bp DNA Marker1～2：pGEX-4T-1- W16-CA-MA PCR 1：pGEX-4T-1- W16-CA-MA2：pGEX-4T-1- W16-CA-MA / EcoR Ⅰ＋Sal 2. 1. 3 重组质粒的测序鉴定测序结果证实, 重组质粒 pGEX-4T-1- W16-CA-MA 第16位氨基酸的碱基序列为TGG ,其余碱基序列全部一致, 在预定点发生突变，达到预期构建目的（Fig. 3）2. 2 W16-CA-MA突变蛋白的表达突变重组表达质粒 pGEX-4T-1-W16-CA-MA 转化E.coli BL21 中，用 IPTG 可诱导其融合蛋白高效表达，其分子量约为 30KD 与预测大小相符，而未经 IPTG 诱导的细菌总蛋白在此位置没有明显的蛋白条带出现（Fig. 4）。

Fig.3 重组质粒测序图Fig.4 pGEX-4T-1-W16-CA-MA 及 GEX-4T-1-CA-MA在 E.coli BL21 中的表达M: 低分子量标准蛋白质 Marker1：pGEX-4T-1-W16-CA-MA 表达 5 h2：pGEX-4T-1-W16-CA-MA 表达 0 h3：pGEX-4T-1-W16-CA-MA 表达 3 h3讨论重组基因抗菌肽与人工设计合成的抗菌肽在保持高效抗微生物活性的前提下，具有热稳定性、没有抗原性、没有溶血作用等优点，具有较好的开发应用前景[7]。

天蚕素A-蛙皮素杂合基因抗菌肽〔CA (1～8) - MA (1～12) 〕由天蚕素 A 和蛙皮素的 N 端区域组成,与它们的亲代肽比较,其抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。

Lee DG 等发现 CA-MA 杂合肽第 16 位的丝氨酸对抗微生物活性具有重要作用，其疏水性对于 CA-MA 杂合肽抗病毒活性有重要影响[2]。

本工作运用不同的生物学软件对 CA-MA 杂合肽基因进行分析，模拟 CA-MA 杂合肽结构，寻找合适的突变位点[2,8]，用色氨酸取代 16 位的丝氨酸，以增强抗病毒活性。

定点突变有寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变和以 PCR 为基础的定点突变等方法[9]。

近几年来,以 PCR 为基础的定点突变得到不断的创新和改进。

PCR 体外定点突变技术是研究 DNA 结构和功能关系的重要途径，可在 DNA 片段的任何位置定点突变[5]。

通过定点突变 DNA 片段可以达到改造蛋白结构和功能的目的;与人工合成肽的方法相比,成本较低,同时还可为用生物法大规模制备蛋白提供一定的技术支持[10]。

本研究采用 PCR 体外定点突变技术[11]，成功地对其进行定点突变，并融合表达W16-CA-MA 突变蛋白。

实验表明，该方法且快速、简便、准确、突变率高，是一种较为实用的定点突变方法。

本实验成功构建了CA-MA 杂合肽的突变体W16-CA-MA ，该突变体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，为该肽和基因工程抗病毒药物的研发奠定了基础。

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