Genomeshuffling技术选育高耐性酿酒酵母
一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910671709.7(22)申请日 2019.07.24(83)生物保藏信息CGMCC No.17924 2019.06.13CGMCC No.18090 2019.07.08(71)申请人 上海中溶科技有限公司地址 200000 上海市浦东新区中国(上海)自由贸易试验区世纪大道1200号19层008号席位(72)发明人 李秋园 杨何宝 代淑梅 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限公司 31225代理人 褚明伟(51)Int.Cl.C12N 1/18(2006.01)C12N 13/00(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12P 19/00(2006.01)C12P 7/10(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(54)发明名称一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用(57)摘要本发明涉及一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用，该耐抑制物的酿酒酵母，命名为Z R /S C -U V -2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其选育方法为：以能够利用木糖的酿酒酵母菌为出发菌株，经过紫外诱变筛选得到所述耐抑制物的酿酒酵母菌。
所述紫外诱变的条件为：避光条件下，采用15～20W紫外灯在15～20cm的照射距离下照射30～600s，进行紫外诱变。
与现有技术相比，本发明酿酒酵母菌对纤维素水解液中的抑制物耐受性强、对木糖的降解率高、发酵时间短，适用于农业秸秆制备乙醇的产业化生产。
权利要求书2页 说明书7页 附图1页CN 110358690 A 2019.10.22C N 110358690A1.一种耐抑制物的酿酒酵母菌，其特征在于，该耐抑制物的酿酒酵母，命名为ZR/SC-UV-2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
基因组改组构建柔红霉素高产菌株
基因组改组构建柔红霉素高产菌株摘要:目的:构建高产菌株,提高柔红霉素发酵效价。
方法:使用基因组改组法,用摇瓶测试发酵效价。
结果:使柔红霉素效价提高105%。
结论:使用基因组改组的方法可以大幅度的提高柔红霉素发酵效价。
关键词:柔红霉素菌株基因组重排临床上盐酸柔红霉素是治疗急性非淋巴细胞性白血病的一线药物,对儿童白血病也有良好的缓解作用,30年没有被其他药物取代。
在制药领域是去甲氧柔红霉素、阿霉素和表阿霉素的合成起始原料。
随着人类的癌症发病率逐年提高,盐酸柔红霉素的市场容量也在快速上升,2009年被收录到《国家基本医疗保险药品目录》。
然而较低的发酵效价造成了昂贵的生产成本,致使售价居高不下。
降低生产成本,减少患者的负担是我们当前迫切需要解决的问题。
2002年建立的基因组改组(genome shuffling)技术,应用多亲本递近融合(recursive fusion),定向筛选具有重要表型特征改变的突变体,已经成功地用于工业微生物多基因控制表型的改良[1～4]。
高雯采用紫外诱变和基因组改组相结合的方法构建柔红霉素高产菌株,使发酵单位提高60%[5]。
刘连碧等使用链霉素抗性筛选法,提高柔红霉素发酵单位50%[6]。
本次研究将采用盐酸胍和紫外联合诱变与基因组改组相结合的方法,并使用链霉素抗性筛选法进行柔红霉素高产菌株的构建。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种亲本:S-07A:发酵效价为1000mg/L。
保存于鲁南制药科研部。
1.1.2 融合培养基及试剂[7]亚硝基胍(NTG),甲醇(AR),0.9%生理盐水,YEME液体培养基,10.3%蔗糖溶液,TSA平板,P缓冲液,10mg/ml溶菌酶溶液(用P缓冲液溶解),25% PEG4000(用P缓冲液溶解),R2软琼脂,R2YE平板。
TM缓冲液(Tris-马来酸缓冲液):Tris0.121g,马来酸0.116g,纯化水20ml调节pH6.0,121℃灭菌5min。
genomeshuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用(一)
genomeshuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用(一)应用介绍：genome shuffling 在酿酒酵母菌种选育中什么是 genome shuffling？Genome shuffling（染色体重排）是一种用于微生物菌种改良的技术。
该技术通过随机化和再组合细胞中的基因来产生多样性，并选取出具有所需性状的优良菌株。
应用一：改善酿酒酵母菌种的风味特性•genome shuffling 通过重新排列酿酒酵母菌的基因，可以改变其代谢途径和酶的活性，从而影响酿造过程中的风味特性。
•通过多次重排基因并筛选，研究人员可以获得新型的酿酒酵母菌菌株，其产生的风味更符合市场需求，提高产品质量和竞争力。
应用二：提高酿酒酵母菌的抗逆性•genome shuffling 可以创造更强健和适应力更强的酿酒酵母菌种，使其能够在恶劣环境条件下生存和工作。
•经过 genome shuffling 后的菌株能够更好地抵抗酒精浓度、温度变化、酸碱环境等因素的影响，提高了酿酒过程中的稳定性和产量。
应用三：提高酿酒酵母菌的营养利用能力•使用 genome shuffling 技术，科研人员可以改变酿酒酵母菌对不同营养物质的利用效率和速度。
•酿酒酵母菌通过基因重排和再组合，可以提高对葡萄糖、麦芽糖等碳源的利用效率，从而提高发酵过程中的产酒量和发酵速度。
应用四：减少酿酒酵母菌产生的副产物•genome shuffling 可以减少酿酒过程中产生的副产物，如乙酸、甲醇等对产品质量和风味的不利影响。
•通过选择具有高效代谢副产物能力的酿酒酵母菌株，将其基因与其他有利基因重排和再组合，可以获得产物质量更好的酒精发酵菌株。
结论通过 genome shuffling 技术，酿酒业不仅能够改善产品的风味特性，提高菌株的稳定性和产量，还能够减少产生的副产物，提高产品质量和市场竞争力。
这使得 genome shuffling 技术在酿酒酵母菌种选育中具有广阔的应用前景。
高耐性酿酒酵母菌种的筛选
２００６ 年第 ９ 期 （ 总第 １４７ 期 ）・ ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００６ Ｎｏ．９（Ｔｏｌ．１４７）
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高耐性酿酒酵母菌种的筛选
吴
摘 要：
帅 ， 肖冬光 ， 原通磊 ， 赵
旭
３００２２２）
（ 天津科技大学生物工程学院 ， 天津
利 用 耐 酒 精 和 耐 渗 试 验 方 法 选 出 耐 性 良 好 的 ６ 株 酿 酒 酵 母 Ｙ－ １ ， Ｙ－ ２ ， ＡＹ－ １５ ， Ｍ１ ，
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酿酒科技
ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００６ Ｎｏ．９（Ｔｏｌ．１４７） ２００６ 年第 ９ 期 （ 总第 １４７ 期 ）・
本文通过比较菌株的产酒精能力、 相对耐渗性及耐 高温性能 ， 对实验室现有保藏菌种进行筛选 ， 以得到耐 性优良的酿酒酵母菌株 ， 同时对酵母耐性的相关性进行 分析 ， 为菌种选育提供理论依据。
２
结果与分析
２．１ 杜氏管耐性试验 ２．１．１ 耐酒精试验
在浓醪发酵时 ， 高浓度底物相应地也会生成较高浓 度的酒精 ， 过高的酒精浓度对酵母有毒性 ， 会抑制细胞 的生长及发酵活性。所以 ， 酵母的发酵能力在很大程度 上取决于它们自身酒精耐受力的大小。 在评价酵母的酒 精耐性试验中 ， 最广泛使用的方法是比较细胞在外加酒 精的培养基中生长时受到的抑制程度。 本试验通过杜氏 管发酵 ， 比较酵母菌在含酒精培养基中的产气速度和产 气量的多少 ， 对不同酵母菌株的酒精耐性进行分析 ， 结 果见表 １ 。 由表 １ 可知 ， 高酒精度对酵母的生长繁殖有延滞作 用。 Ｙ－ １， Ｙ－ ２， ＡＹ－ １５， Ｍ２ 均能耐酒精度 １８ ％Ｖｏｌ。 Ｙ－ １， Ｙ－ ２ 在 含 酒 精 １６ ％Ｖｏｌ 的 试 管 中 发 酵 ２４ ｈ 后 气 体 满 管 ， ＡＹ－ １２ ， ＡＹ－ １５ 产生的气体未满管 ， 说明 Ｙ－ １ ， Ｙ－ ２ 比 ＡＹ－ １２ ， ＡＹ－ １５ 耐酒精能力强。对比 １６ ％Ｖｏｌ ， １８ ％ Ｖｏｌ 试管的发酵情况 ， 可以看出 ， Ｙ－ １ 比 Ｙ－ ２ 更耐高浓 度的酒精。 菌株 ＡＹ－ １２ 耐酒精能力较差 ， 在酒精度大于 的培养基中不再生长。 １８ ％Ｖｏｌ ＴＹ－ ５ 在酒精含量为 １２ ％Ｖｏｌ 的麦汁中发酵到 １２ ｈ 时 ， 仅有少量气体产生 ， 其 余酒精浓度下酵 母 生 长 被 抑 制 没 有 气 体 产 生 ； ＣＹＫ 一 直无气体产生 （ 表中未注明 ） 。 由以上结果可以判定 ＴＹ－ ５， ＣＹＫ， ＡＹ－ １２ ３ 株酵母的耐酒精能力最差。 ２．１．２ 耐渗试验 发酵醪液的渗透压较高 ， 引起细胞内水分活度、 细 ［５］ 胞质组成 发生显著变化 ， 酵母的细胞膜和菌体内的酶 受到破坏 ， 从而抑制酵母的生长和发酵。本试验以 ＮａＣｌ
耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定
耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定彭源德;朱作华;唐守伟;严理;温岚;汤清明;熊和平【摘要】针对传统酿酒酵母的酒精发酵温度低、耐酒性差、乙醇产率低和成本高等问题,进行了耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定研究.通过广泛采集菌样,初筛、复筛,从22个样品中经分离得到S11、S12、S15、S17 4株在40℃均能较好生长的耐高温酵母菌:对S15、S17菌株进行紫外诱变育种,获得1株编号为S132的耐受性优良酒精酵母.与对照丹宝利耐高温酵母相比,S132耐受40℃高温和16%(v,v)乙醇的能力分别高出20.9%和15%,是一株良好的高耐受性酒精酵母.【期刊名称】《中国麻业科学》【年(卷),期】2010(032)003【总页数】6页(P135-139,142)【关键词】耐受性;酵母菌;酒精发酵【作者】彭源德;朱作华;唐守伟;严理;温岚;汤清明;熊和平【作者单位】中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205【正文语种】中文【中图分类】Q93-335石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球枯竭的局面。
特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。
针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。
传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃-30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10%左右。
genomeshuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用
genomeshuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用Genomeshuffling（基因组重组技术）是一种在酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）种选育中应用广泛的方法。
它是一种基于自然染色体重组和突变的技术，旨在创造和筛选出具有改良特性的菌株。
以下是genomeshuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用：
1. 改良酿酒酵母菌特性：通过genomeshuffling，可以将多个母菌菌株的染色体组合进行随机重组，形成新的菌株群体。
这样可以引入多样化的基因组变异，并筛选出具有改良特性的菌株。
例如，可以筛选出产酒精能力更强、耐高温或者耐酸的菌株。
2. 提高产酒精效率：genomeshuffling可以应用于提高酿酒酵母菌的产酒精效率。
通过基因组重组和随机突变，可以筛选出产酒精能力更高的菌株，从而提高酿酒过程中的酒精产量。
3. 改进口感和风味：酿酒酵母菌的代谢能力和发酵产物会对酿造的酒品质产生重要影响。
利用genomeshuffling技术可以创造出新的菌株，调控酵母对糖分的利用和代谢途径，从而改善酒的风味和口感。
4. 适应不同发酵环境：genomeshuffling可以增强酿酒酵母菌对不同发酵环境的适应能力。
例如，可以通过重组和突变增强酵母对低温发酵或高温条件下的生存和发酵能力，以适应不同的酿酒环境。
总的来说，genomeshuffling是一种有效的酿酒酵母菌选育方法，它通过基因组重组和突变创造多样性，可以获得具有改良特性的菌株，提高产量、改进口感和适应不同的酿酒条件。
这种技术对于酿酒行业的发展和酿造高质量的酒品具有重要意义。
Genome shuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用
Genome shuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用
孙红兵;宋刚;平文祥;葛菁萍
【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】2010(0)4
【摘要】Cenome shuffling(基因组改组)作为一种新型的菌种选育方法,与常见的育种方法相比,具有快速有效、简单易行和实用性强等特点,近年来不断应用于各种工业微生物菌种的改良研究中.论述了Genome shuffling的产生与原理、技术过程及其在酿酒酵母中的应用和发展前景.
【总页数】4页(P68-71)
【作者】孙红兵;宋刚;平文祥;葛菁萍
【作者单位】黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080;黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080;黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080;黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150080
【正文语种】中文
【中图分类】Q933
【相关文献】
1.Genome Shuffling技术在微生物遗传育种中的应用 [J], 史晓昆;王秀然;刘东波
2.Genome shuffling技术在微生物育种中的应用 [J], 杜云平;周庆丰;余国莲;李小
军;梁健良;刘建忠
3.Genome shuffling研究进展及其在微生物育种中的应用 [J], 申乃坤;张红岩;王青艳;黄日波
4.Genome shuffling在菌种改良中的应用 [J], 朱欣杰;程瑶
5.Genome Shuffling技术原理及其在菌种改良中的应用 [J], 胡冰
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高产谷胱甘肽酿酒酵母的微生物育种策略
姓名：马荣琴 学号：20140897 专业：微生物
谷胱甘肽:
• 谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种具有重 要的生理功能的活性三肽，具有清除自由 基、解毒、延缓衰老和抗疲劳等多种生理 功效。目前生产上最常用的是发酵法，发 酵法生产谷胱甘肽的基础是选育一株稳定 高产的优良菌株。其选育方法主要有以下 几种：
基因组重排技术选育谷胱甘肽高产菌株
• 基因组重排技术是在上个世纪 90 年代被提出， 关于提出者国内的文献里还存在一些争议，本文 参考的是美国加州 Maxgen 公司的Cardayre 等人 提出的基因组重排技术(Genome shuffling)的概念： 在传统诱变的基础上，经过多轮(3 轮以上)原生质 体递推式融合，使多个亲本杂交，产生带有正向 进化标记的融合子代。该技术将传统诱变育种与 原生质体融合技术有机结合，大大加快菌株正向 突变的进程。因为其在菌株改造方面的优异表现， 被称为是微生物育种和代谢工程上的里程碑。
基因工程技术选育谷胱甘肽高产菌株 • 基因工程技术(gene engineering)是指将特 定基因导入生物体内，提高基因在生物体 内的表达量，改变生物的代谢途径，增加 酶活性的一种分子生物学技术。基因工程 育种技术可实现超远缘杂交，是一种可预 先设计和控制的育种新技术，其筛选标记 广泛、机理较明确、高产菌株的筛选率比 较高，近 20 年来发展较快。国内也有许多 学者正在致力于研究利用这种技术来提高 GSH 产量。
基因组重排技术的原理
• 基因组重排技术是在原生质体融合技术的 基础上，使不同基因组发生重排的过程。 其主要机制是利用原生质体融合将全基因 组片段交换重组，使多个亲本的优良表型 通过多轮的、随机的原生质体递归融合集 中于同一菌株，高效选育出我们所需要的 目标菌株。
微生物菌种诱变筛选方法及其应用
微生物菌种诱变筛选方法及其应用许翠;高梦祥【摘要】野生微生物菌株的代谢产物的产量通常很低，不能满足工业生产的需求，因此简单高效、定向稳定的微生物菌种诱变技术和快速、有效的高通量筛选方法在微生物菌种选育中显得至关重要。
综述了近年来国内外微生物菌种诱变筛选领域出现的新技术和新方法，可为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供参考。
【期刊名称】《长江大学学报（自科版）农学卷》【年(卷),期】2013(000)012【总页数】5页(P56-60)【关键词】微生物;菌种;诱变;筛选【作者】许翠;高梦祥【作者单位】长江大学生命科学学院，湖北荆州434025;长江大学生命科学学院，湖北荆州434025【正文语种】中文【中图分类】Q933微生物具有独特和高效的生物转化能力，能产生多种代谢产物，其产物中的一些生物活性物质（如抗生素、氨基酸、糖肽等）在医药、食品和化工工业中有着不可取代的地位［1］。
然而，通常从自然界分离得到的野生菌株代谢产物产量往往很低，远不能满足工业生产的需要，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改良，以获得高产高效的优良工业菌株。
而微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种［2］，以降低生产成本［3］。
微生物诱变处理一般采取物理诱变方法，如紫外线（UV）、X射线等和化学诱变方法如碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）等传统方法。
但是，这些方法具有耗时、费力、工作量大以及诱变结果不具定向性等缺点。
随着生命科学技术的发展以及学科交叉的深入，基因工程、原生质体融合和生物信息学等的应用日益广泛，使得菌种改良技术得到了不断的发展和创新，从而为筛选得到更多优质、高效菌种提供了技术上的可能和便利［4］。
为此，笔者综述了近年来国内外出现的微生物菌种诱变新技术以及新的筛选方法在微生物菌株选育中的应用，旨在为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供启迪和参考。
GENOMESHUFFLING技术优化及其应用进展
ｌ ｇ ｆｎ 的早期研究 中， ｉ 大多选用 的是单一诱变剂 。０ 年 ，ｈｎ ２ Ｚ ａｄ］ 等仅 利用 Ｎ Ｇ对 Ｓｒｐｏ ｅ ｓｒｄａ Ｔ ｔｅ ｔｍｙｅ ａ ｉｅ进行诱 变筛选 。随着 ｆ
ｇ ｎ ｍｅ ｈ ｆｉｇ ｅ ｏ ｕ ｎ 技术研究的深入 ，人们越 来越倾 向于采 用多 ｓ ｌ
２３ 原生质体 融合 ．
得到优化的重组子作为下一轮融合 的出发菌株 。 通过递推式原
生质体融合 ， 突变库 中的基 因组得 到较充分 的重排 ， 同时获得 表型最优 的后代 。 ２０ ０ ２年 ， ｘ ｅ 司 的 Ｚ ａ ｇ 等首次 将 ｇｎ ｍｅｓｕ－ Ｍａｇ ｎ公 ｈｎｔ ｅ ｏ ｈ ｆ ｌ ｇ ｆｎ 技术应用于弗氏链霉菌 （ｔｅ ｔｍｙ ｅ ｆ ｄａ ）研究显示 ｉ Ｓｒｐｏ ｅ ｓ ｒ ｉｅ ， ａ
来都倍受人们关注。 自上个世 纪以来 ， 微生物育种技术先后经
组 中不 同位点的多个基 因的重排 ，突变库遗传背景越丰 富， 融
合过程 中的重排 效果越佳 ， 所以 ｇ ｎ ｍｅ ｈ ｆ ｉｇ ｅ ｏ ｕ ｎ 第一步就是 ｓ ｌ 建立起具有 明显遗传差异 的阳性突变子库 。在 ｇｎ ｍｅ ｈ ｆ ｅ ｏ ｕ－ ｓ
用 Ｕ Ｅ ，０ ｏ和 Ｎ Ｇ 四种方法 对 Ｎ ｄ ｌ ｐ ｒ ｍ ｓｌｉ Ｖ， ＭＳ６ Ｃ Ｔ ｏ ｕｉ ｏｉ ｙｖ— ｓ ｕ
１ ｇ ｏ ｈ ｆｌ ｅｎ ｍｅｓ ｕ ｆｌ ｎｇ技术 的建 立和 原理
１９ ９ ４年 ，ｔｍｍ ｒ 率先 提 出 了 Ｄ Ａ 改 组 技术 （ Ｎ ｓ ｅ ｅ等 Ｎ ＤＡ ｓｕｆｎ ） ｈ ｆ ｉｇ 。ＤＮ ｕｆ ｎ 在一定程度上模仿了生物体 自然进 ｌ Ａｓ ｆｉｇ ｈｌ
成一定的影响 ， 使融合 子代 “ 先天不 足”同时筛选本 身又是一 ， 个费时费力 的过程 ， 随后 的 ｇｎ ｍ ｕ ｉ 研究中则更 因此 ｅｏ ｅ ｈ ｆ ｎ ｓ ｌ ｇ
微生物基因组重排技术研究进展
微生物基因组重排技术研究进展作者：仝倩倩李亚亮王顺昌颜守保来源：《赤峰学院学报·自然科学版》2019年第10期摘要：基因组重排技术是21世纪初发展起来的基于全基因组的定向微生物菌种改良技术.本文介绍了基因组重排技术的原理，并重点概述了基因组重排的具体过程，最后对基因组重排技术的发展进行了展望.关键词：基因组重排;递推;原生质体融合;育种中图分类号：Q789; 文献标识码：A; 文章编号：1673-260X（2019）10-0018-02基因组重排技术（genome shuffling）是一种基于整个微生物基因组重排的定向菌种改良技术，2002年，Zhang首先提出基因组重排这一概念：它无须提前知道菌株的代谢途径及基因表达调控机制等遗传背景，直接对微生物进行全基因组重排[1]，现在已被视为一种有效的微生物育种方法.1 基因组重排原理基因组重排是在传统诱变育种获得突变株后，通过递推式原生质体融合技术，对突变株的原生质体进行基因组重排，将正突变的基因集中在一起，从而大大提升菌株的正向突变的频率及突变的速率.基因组重排技术一般被用于改良甚至改造微生物的基因，从而获得性状更加优良的表型.基因组重排技术与经典的杂交育种技术不同之处在于，后者在每次重排时只有两个亲本，然而基因组重排技术却是两个以上的多亲本杂交，并且通过反复的递推式杂交，从而产生很多表型改良显著的新突变株[1-3].2 基因组重排具体方法基因组重排技术通过模拟自然进化过程，将突变菌库中的带有不同遗传性状的正变菌株基因进行多亲本融合，在全基因组范围内随机交换基因，通过筛选，剔除基因组中的不利的变异基因，在递推式融合中，将突变菌株库中的有利基因逐渐积累，从而完成跳跃性人工进化.基因组重排育种技术主要分五步：2.1 突变菌株库的建立基因组重排育种技术首先会构建一个包含不同遗传特性的突变菌株库，其中的亲本拥有多种多样的基因，在后续的递推式原生质体融合时，不同的优良性状可以进行剪接，然后统一集中到融合体中.通常，突变菌株库可借助自然分离、诱变育种等常见技术建立，从而获得更多带有多样性基因的亲本.2.2 亲本的筛选当利用诱变育种技术进行微生物菌种选育时，“选”与“育”要结合起来，提高诱变效率.首先进行“育”：通过各种诱变手段（如物理诱变、化学诱变等），使菌株产生基因型突变，但该突变是不定向的，只有极少部分是正突变;再进行“选”：借助各种筛选方法筛选出具有某特定表型的突变株，如能够耐受不良环境（如某种浓度的抗生素、前体或不同的pH等），从绝大部分的负突变中快速筛选出正突变，进一步提高筛选效率.2.3 親本原生质体的制备原生质体融合技术是基因组重排技术的基础，又很多因素会直接影响原生质体制备及再生效果，如微生物的菌龄、制备原生质体的酶种类及浓度、酶解温度及时间、缓冲液及再生培养基的成分与设计等.李亮等[4]在利用基因组重排技术选育红曲霉菌SH2-7生产治疗心血管良药的洛伐他汀时对原生质体制备及再生条件进行了考察，结果表明，当溶壁酶为1.0%，菌丝菌龄为66h，在酶解温度为30℃下酶解3h，采用pH为6.0的高渗磷酸盐缓冲液，0.6mo/L的NaCl作为再生培养基的渗透压稳定剂时，原生质体再生率高达1.45%.2.4 原生质体递推式融合基因组重排技术是基于原生质体融合技术的多轮递推式融合[5]，此种方式的融合不仅能提高不同遗传特征细胞之间的基因频率，还能进一步提高基因组重排的高效性.第一轮融合后，筛选出若干株性状比较优良的菌株作为亲本，按照相同的操作方法进行第二轮融合.根据研究人员的原始意图和融合子最终显示的特性，可以实施若干轮融合.原生质体融合的方法主要包括化学法及电诱导融合等方法.化学法是利用聚乙二醇促进融合，如Zhang等[6]建立了一种优化的聚乙二醇介导的原生质体转化系统，用于黑曲霉ATCC 20611高效生产低聚果糖.电诱导融合法是基于电学和生物化学的理论.在电场作用下，原生质体向电极方向泳动，同时，在细胞内产生偶极化，以促进原生质体的粘附，最终使原生质体在短时间内发生融合.Ye等[7]为了让苹果酒更富有风味和香气，对酿酒酵母和克鲁氏假丝酵母的灭活原生质体进行电诱导融合，最终获得一株感官评分和香气成分含量得分最高的杂交R4.2.5 融合子的筛选融合子的检出和鉴定在基因组重排中占据非常重要的地位.通常可依据基因组重排的目的进行重组子的筛选，可借助菌株对环境的不同耐受力，或设计一些选择性培养基来实现.Wang 等[8]以分离到的Lactobacillus plantarum IMAU10014及Lactobacillus helveticus IMAU40097为材料，以Penicillium digitatum KM08模式菌为指示菌，通过基因组重排技术提高乳酸菌抗真菌活性.Gérando[9]等利用随机诱变及基因组重排技术，提高了厌氧菌Clostridium beijerinckii DSM 溶剂耐受性及异丙醇/丁醇/乙醇的产量，极大改善自然异丙醇产生菌的表型.另外，还可通过灭活法来筛选重组体.如Yin等[10]为了提高酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YS86产谷胱甘肽的产量，利用紫外照射和加热处理获得致死的原生质体，并对其进行两轮基因组重排，最终获得高产的重组子YSF2-19，其在摇瓶和发酵罐中谷胱甘肽产量分别增加了3.2及3.3倍.笔者[11]利用紫外线照射及加热灭活处理Streptomyces virginiae原生质体，在链霉素抗性压力下，并对其进行五轮基因组重排，最终获得一株维吉尼亚霉素产量稳定的重组子G5-103，产量约为251mg/L，比亲本UV-1150及野生株提高3.1及11.6倍.3 基因組重排技术存的问题与展望目前，基因组重排技术面临很多瓶颈，其中融合子的高通量筛选是最难攻克的环节，现尚无快速高效的筛选方法，需要研究者借助已有知识及技术深入挖掘.另外，由于跨种属亲本之间同源性较差，重组概率较低，因此基因组重排技术很少用于不同种亲本的融合.基因组重排技术自2002年问世以来便受到人们的广泛关注，并应用在各种微生物菌种改良中，取得了巨大的经济及社会效益.随着自身技术的发展及生物信息学、蛋白质组学等生物技术的成熟，基因组重排技术必然成为日后开发新产品、新物种的有力技术，为加速微生物菌种改良，进一步促进产业化做出贡献.参考文献：〔1〕Zhang Y X.， Perry K.， Vinci V A.， et al. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria [J]. Nature，2002，415（6872）：644-646.〔2〕Powell K A.， Ramer S W.， Stephen B.， et al. Directed Evolution and Biocatalysis [J]. Angewandte Chemie International Edition， 2001，40（21）：3948-3959.〔3〕Stemmer W P C. Molecular Breeding of Genes， Pathways and Genomes by Dna Shuffling [J]. Biotechnology & Bioprocess Engineering，2002，7（3）：121-129.〔4〕李亮，林娟，叶秀云.利用基因组重排技术选育高产洛伐他汀红曲菌株[J].福州大学学报（自然科学版），2017（5）：754-760.〔5〕仝倩倩.高通量筛选及基因组重排选育维吉尼亚霉素高产菌[D].2018.〔6〕Zhang J.， Liu C.， Xie Y.， et al. Enhancing fructooligosaccharides production by genetic improvement of the industrial fungus Aspergillus niger ATCC 20611[J]. Journal of Biotechnology， 2017， 249：25-33.〔7〕Ye M.， Yue T.， Yuan Y.， et al. Production of yeast hybrids for improvement of cider by protoplast electrofusion[J]. Biochemical Engineering Journal，2013，81：162-169.〔8〕Wang H K.， Sun Y.， Chen C.， et al. Genome shuffling of Lactobacillus plantarum for improving antifungal activity[J]. Food Control，2013，32（2）：341-347.〔9〕Gérando H.， Máté de.， Fayolle-Guichard F.， et al. Improving isopropanol tolerance and production of Clostridium beijerinckii DSM 6423 by random mutagenesis and genomeshuffling[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2016，100（12）：5427-5436.〔10〕Yin H.， Ma Y.， Deng Y.， et al. Genome shuffling of Saccharomyces cerevisiae for enhanced glutathione yield and relative gene expression analysis using fluorescent quantitation reverse transcription polymerase chain reaction[J]. Journal of Microbiological Methods，2016，127：188-192.〔11〕Tong Q Q.， Zhou Y H.， Chen X S.， et al. Genome shuffling and ribosome engineering of Streptomyces virginiae for improved virginiamycin production[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering，2018（41）：729-738.。
高耐性酿酒酵母的筛选及其耐受性研究
高耐性酿酒酵母的筛选及其耐受性研究付肖蒙;王鹏飞;郝爱丽;洪坤强;肖冬光【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)010【摘要】优良的耐逆性菌株的添加能有效提高酱油生产效率和产品品质风味,该研究筛选出两株耐高温、耐高渗和耐高酸的酵母菌株用于酱油发酵.通过对酵母菌株高温热激之后稀释点板,对比各稀释度的菌落数量和形态,以及通过在高渗板和高酸板上各个菌的生长情况和在抗性培养基中菌的生长曲线测定来对比各菌株的耐受性.稀释点板实验以及生长曲线结果都显示,酿酒酵母L-19和L-38在55℃热激条件下以及在分别含有6％NaC1、0.6％乙酸和5％乳酸固体平板上菌落形态和大小都优于酱油酵母,而且在含有高盐和高酸的液体培养基中生长速率均高于酱油酵母.因此,成功筛选出两株具有高耐性的酿酒酵母.【总页数】4页(P23-26)【作者】付肖蒙;王鹏飞;郝爱丽;洪坤强;肖冬光【作者单位】天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457【正文语种】中文【中图分类】TS261.1【相关文献】1.柿中酿酒酵母的筛选及其耐性研究 [J], 王倩2.铅高耐受性细菌的筛选及其吸附去除水中铅的初步研究 [J], 邓沙宁;齐利敏3.高耐性酿酒酵母菌种的筛选 [J], 吴帅;肖冬光;原通磊;赵旭4.高耐性酿酒酵母的筛选及耐受性分析 [J], 牟来庆;张奏娟5.EMS诱变高异丁醇耐受性酿酒酵母的筛选 [J], 温智慧;李敬知;冯瑞琪;苏意德;张爱利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
耐酸、耐乙醇、耐高温酵母菌的选育
耐酸、耐乙醇、耐高温酵母菌的选育一、课题目的和意义浓香型白酒的生产是泥窖固态发酵，酵母菌利用葡萄糖生成乙醇为主要代谢产物的复杂过程，发酵过程中温度难以控制。
酵母菌最适发酵温度在30-33 O C，发酵基质的温度过高易造成酵母菌代谢活力减退甚至大量死亡，导致其他微生物的过度繁殖，影响白酒的产量和质量。
据测算在固态发酵乙醇过程中，每消耗1％的淀粉可导致酒醅温度升高约2 O C。
耐高温酵母不仅有利于提高白酒的产量和质量，尤其是在夏季，室温过高，酒醅温度难以做低，不能做到低温入池，白酒产量和质量往往难以把握，耐高温酵母可以保证白酒的正常生产。
此外，在白酒发酵过程中，酵母菌也会遇到各种各样的环境压力及自身代谢产物的影响，如高渗透压、高浓度乙醇、酸等。
因此，选育耐酸耐高温且发酵性能良好的酵母菌株是十分必要的。
本研究欲从酒醅中筛选发“三耐一好酵母菌（耐酸、耐高温、耐乙醇、发酵能力好）”，在酒醅发酵的复杂环境中迅速繁殖，缩短迟缓期，防止产酸细菌的侵袭，发酵产酒精能力好，使酒醅在短期就达到较高的酒精浓度，以抑制杂菌繁殖，而且有一定的后繁殖能力，在高乙醇浓度的酒醅中能继续发酵代谢，以提高浓香型白酒的产量。
二、研究内容1、酒醅中酵母菌的筛选，包括酵母菌的分离纯化、经过产气和TTC平板试验，筛选活力强、发酵力强的酵母菌；之后通过耐酸、耐温、耐乙醇实验进行复筛2、选育菌株的生理生化性能测定，包括菌株产子囊孢子实验，糖类发酵实验(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、乳糖)，pH对菌株酒精发酵的影响，菌株对乙醇浓度的耐受能力。
3、选育菌株的白酒固态发酵条件模拟4、将选育菌株制成酵母菌强化大曲，添加的酒醅中发酵，并进行跟踪实验，观察效果，以其降低大曲的用量，提高酒的产量和质量。
三、所用培养基分离培养基YPD培养基(用于酵母分离的合成培养基)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(用于酵母分离的自然培养基)；初筛培养基产酯培养基(用于筛选产酯能力较强的酵母菌)、TTC上层培养基(用于筛选产酒精能力较强的酵母菌)、TTC下层培养基(YPD琼脂，用于酵母的纯培养)。
刘红全基因组改组快速提高日本小球藻脂肪产量
基因组改组快速提高日本小球藻脂肪产量刘红全，袁莎，卢恩秋，潘艺华，杨海燕，龙寒，禤金彩，何秀苗（广西民族大学海洋与生物技术学院/广西多糖材料与改性重点实验室培育基地，广西南宁530007）收稿日期：2017－04－11作者简介：刘红全（1975－），男，博士，副教授，主要从事植物分子生物学方面的研究，E－mail ：lhongquan@ 。
基金项目：国家自然科学基金（30960215）；广西自然科学基金（桂科青0728019）；广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目。
摘要：以日本小球藻为出发藻株，经过紫外线和甲基磺酸乙酯分别诱变处理，获得4株总脂产量有所提高的突变株。
以聚乙二醇作为融合剂，对获得的突变株进行两轮递归式原生质体融合，筛选到遗传稳定的改组藻株F2C2，其总脂含量为59.01%，较原始藻株提高了101.4%。
对日本小球藻的原始藻株和改组藻株F2C2的油脂含量进行分析，结果表明改组前后日本小球藻的总脂组成成分没有变化，但各组分含量有较大差别。
关键词：基因组改组，总脂含量，日本小球藻Increase the lipid production ofChlorella hirataii rapidly by genome shufflingLIU Hong －quan ，YUAN Sha ，LU En －qiu ，PAN Yi －hua ，YANG Hai －yan ，LONG Han ，XUAN Jin －cai ，HE Xiu －miao（College of Ocean and Biotechnology ，Guangxi University for Nationalities ，Guangxi Key Laboratory CultivationBase for Polysaccharide Materials and their Modification ，Nanning 530007，China ）Abstract ：Strain Chlorella hirataii was used as the starting strains for genome shuffling.They were mutated by UV－light andethylmesylate separately ，and four mutant strains with increased lipids yield were selected.Two rounds of genome shuffling were carried out with the four mutant strains using PEG to mediate protoplasts fusion.Finally ，the Chlorella hirataii F2C2was selected which produced lipids （59.01%）higher than the original strain by 101.4%.Compare with the original strain in the same batch ，the total lipid composition of the Chlorella hirataii F2C2didn ’t change a lot ，but there was a big gap between the content of each component.Key words ：genome shuffling ；total lipid content ；Chlorella hirataii 中图分类号：TS201.3文献标识码：A 文章编号：1002－0306（2017）21－0096－04doi ：10．13386/j．issn1002－0306．2017．21．020随着全球经济发展以及人口的快速增长，为降低化石能源资源的消耗，减少对环境的损害，寻求可再生的环境友好型能源已成为当务之急［1］。
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［４］ ［３］
ｆｌｉｎｇ 正是针对机理复杂又不明确的微生物育种的一种 理想方法 ［５］。因此 ， 采用了紫外诱变和 Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ
技术相结合的方法选育符合酒糟利用新工艺的耐性酵 母菌。
１ １．１
材料与方法 菌种
基金项目 ： 贵州省优秀科技教育人才省长专项基金 （ 黔省专合字 ２００６１０２ 号） 。 作者简介 ： 陆筑凤 （１９８４－ ）， 女 ， 浙江嘉兴人 ， 硕士研究生 ， 主要研究方向为应用微生物。 通讯作者 ： 郭坤亮 ， 贵州茅台酒股份有限公司 ， Ｅｍａｉｌ： ｇｕｏｋｕｎｌａｎｇ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
Ｂｒ ｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｔｅｍｐｅｒ ａｔｕｒ ｅ ａｎｄ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｔｏｌｅｒ ａｎｃｅ ｂｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ＬＵ Ｚｈｕ－ｆｅｎｇ１， ＬＩ Ｃｈａｏ２， ＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｌｕ３， ＧＯＮＧ Ｇｕｏ－ｌｉ３ ａｎｄ ＧＵＯ Ｋｕｎ－ｌｉａｎｇ
的菌株。
２．３
摇瓶发酵 上述 ２０ 个菌株与原始的出发菌株相比 ， 在平板上
生长无论是耐高温还是耐乙醇浓度都有了较大提高。 为了检验所筛选的菌株在发酵过程中产乙醇的能力 ， 在
１．３．３
乙醇和总酯产量测定 发酵液蒸馏后 ， 用附温比重瓶测得与水的比重后查
出发酵液在 ２０ ℃ 时对应的浓度。蒸馏液先中和再皂化 后用酸滴定计算总酯的含量［９］。
４６ ℃ 和 １６ ％ｖｏｌ 乙醇浓度的酵母菌。耐高温和耐酒精能力分别提高了 ７ ％和 ３３ ％。经过摇瓶发酵实验后证明 ， 该
菌株在 ３０ ℃ 下发酵 ４ ｄ 酒精度达 １３．８７ ％ｖｏｌ， 总酯产量为 ０．６３７ ｇ／Ｌ， ４２ ℃ 下发酵 ４ ｄ 酒精度达 ５．３０ ％ｖｏｌ ， 总酯产 量为 ０．３１３ ｇ／Ｌ。 关键词 ： 微生物 ； 酿酒酵母 ； 耐高温 ； 耐乙醇 ； 基因组改组 ； 特性分析 中图分类号 ： Ｑ９３－ ３ ； ＴＳ２６１．１ ； Ｑ７８ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １００１－ ９２８６ （ ２００８ ） ０７－ ００２３－ ０３
生质体后等量混合 ， 在 ３５ ％ＰＥＧ－ ６０００ 的促融下对各正 突变株的全基因组进行随机 ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ， 并通过定向筛选 的方法获得了在耐高温或耐乙醇性状上有提高的融合 株。然后 ， 在获得有提高的突变株的基础上 ， 再将有提高 的突变株与通过诱变获得的正突变株随机组合 ， 进一步 用同样方法进行 ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ， 通过筛选以获得耐高温或耐 乙醇性状上更进一步提高的融合株。 多次重复上述方法 后 ， 筛选获得性能有大幅度提高的菌株。
茅台酒的生产取决于其独特的工艺、 特殊的地理环 境以及复杂的微生物体系
［１～２］
但目前实际生产中使用的菌株尚不具备上述多项特性 ， 造成了再利用的产量和质量提高以及工艺简化方面的 局限性。 培育新菌种的方法很多 ， 包括传统筛菌、 诱变、 基因 工程等技术方法。 但是在耐高温和耐酒精机理尚不完全 明确时 ， 基因工程方 法 是 不 切 实 际 的 ， 而 Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆ－
将平板上生长出菌落的时间也作为衡量菌株耐受性的 初筛标志。最先生长出菌落的菌株 ， 在同等条件下 ， 其耐 受性能最好。 凡 ＳＭ 固体平板上生长出来的菌株经 过 相 同 乙 醇 浓度的液体 ＳＭ 培养基验证耐受性 ， 并考虑乙醇挥发对 实验的影响。循序提高温度和乙醇浓度后 ， 分离获得正 突变菌株 ， 并转接到发酵培养基进行性能分析 ， 将这些 紫外诱变正突变菌作为 ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ 育种的出发菌株。
用 ３５ ％ 的 ＰＥＧ－ ６０００ 介导进行 ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ。 采用含乙醇浓 度为 １３ ％ｖｏｌ～１７ ％ｖｏｌ 的 ５ 个梯度的平板筛选 ， 培养温 度为 ４４～４８ ℃ ， 每一浓度的 ＳＭ 培养基灭菌后加入乙 醇再倒到 ６ 个平板中 ， 一次融合筛菌就配制 ５× ６＝ ３０ 个
ＳＭ 平板 ； 其余再配制 ＹＥＰＤ 培养基的 ６ 个平板。
筛菌方法同紫外诱变筛菌 ， 即将融合后的菌液涂布 到各个平板培养 ， 第一组 ： ３０ ℃ 下 ， １ 个 ＹＥＰＤ 平板和 ５ 个 不 同 乙 醇 浓 度 的 ＳＭ 平 板 ； 第 二 组 ： ４４ ℃ 下 ， １ 个
１．３．２
基因组改组参阅文献［７］ 和［８］ 所谓 Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ 是将各正突变株分别制备原
１．２
培养基
１．２．１ 发酵培养基 （ ＦＭ） ： 玉米糖化醪液 ， 葡萄糖浓度为 １５ ％， 固形物浓度 １７° Ｂｒｉｘ。 １．２．２
筛菌培养基 （ ＳＭ） ： 灭菌后的麦芽汁中加入一定
［６］
比例的乙醇配制成的培养基 ， 用于筛选耐酒精性及兼耐 高温菌株 ； ＹＥＰＤ 培养基用于筛选耐高温菌。 本实 其余融合用的再生培养基和试剂参阅文献［６］ 。 验用的蜗牛酶浓度为 ２．０ ％ 。
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５５００２５ ； ２． 华润雪花啤酒河北有限公司 ， 河北 ３００４５７ ）
廊坊
０６５２ห้องสมุดไป่ตู้１ ；
３． 天津科技大学食品生物技术实验室 ， 天津
摘 要：
酿酒酵母对温度和乙醇的耐受性对于茅台酒糟再利用工艺是至关重要的。 通过紫外诱变方法和筛选 ， 获
得了 ５ 个耐性有所提高的正突变株 ， 以这些菌株作为出发菌 ， 进行连续融合 ， 复合筛选融合 子 ， 最 终 获 得 了 能 耐 受
温度和乙醇强制压力筛选耐性酵母 ， 最低抑制浓度和温 度作为酵母的最高耐受浓度 （ ＭＩＣ） 和温度 （ ＭＩＭ） ， 筛选 得到了 ５ 株性能有所提高的酵母 ： ２ 株耐高温菌、 ２ 株耐 乙醇菌、 １ 株既耐高温又耐乙醇的酵母菌 ， 但该方法很 难实现发酵性能的大幅度提升。 将这 ５ 株正突变株接入 发酵培养基发酵 ４ ｄ 后 ， 结果见表 １ 。
ＹＥＰＤ 平板和 ５ 个不同浓度的 ＳＭ 平板 ， 依次类推 ， 分 成 ６ 组在不同条件下筛选性能提高的菌株。 多次组合 ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ 后 ， 筛选到一些耐性提高的菌 株 ， 又 将 这 些 菌 株 与 诱 变 突 变 株 一 起 随 机 组 合 ｓｈｕｆ－ ｆｌｉｎｇ， １０ 个轮次的融合筛菌后 ， 得到了 １００ 株性能有所 提高的酵母菌 ， 表 ２ 为筛选到的 ２０ 株性能大幅度提高
２ ２．１
结果与分析 紫外诱变突变株 微生物次级代谢产物的合成很大程度上受限于产
物 ， 因此 ， 高产乙醇的菌株必能耐受高浓度的乙醇。 采用
３０ ℃ 常温和 ４０ ℃ 高温条件下用摇瓶进行发酵实验 ， 对 比各个菌株发酵液中的最高乙醇浓度。 从表 １ 已经知道 最初的原始菌株在 ３０ ℃ 摇瓶发酵过程中的最高乙醇浓 度仅为 ８．３２ ％ｖｏｌ ， 紫外诱变菌株在 ３０ ℃ 时 的 最 高 乙 醇 浓 度 仅 为 １０．３０ ％ ｖｏｌ ， 提 高 了 ２ ％ 左 右 。 而 经 过 Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ 技 术 获 得 的 ２０ 个 性 能 大 幅 度 提 高 的 菌 株 在 ３０ ℃ 摇 瓶 发 酵 后 发 酵 液 中 的 最 高 乙 醇 浓 度 又 比其出发菌株提高了 ２ ％ ～３ ％ ， 相比原始菌株提高了 ５ ％左右。最高乙醇浓度达到了 １３．８７ ％ｖｏｌ ， 其总酯含量
。其生产注重季节性提升
酒糟处理的压力。由于酒糟酸度大 ， 水分含量在 ６５ ％ 以 上 ， 可生化性强 ， 极易腐败 ， 不便贮存 ， 若不及时处理 ， 对 环境会造成极大的污染 。 另一方面 ， 白酒糟中含有丰富 的营养成分 ， 若能及时有效利用 ， 既能解决环境污染的 问题 ， 又能取得显著的经济效益 ， 是白酒酒糟综合利用 的最优选择。茅台集团利用茅台酒酒糟 ， 开辟了纯种碎 沙酱香白酒生产技术与茅台酒高温酿酒工艺结合并对 茅台酒酒糟进行综合利用的新路子 ， 取得了良好的经济 效益 。 但是 ， 目前存在的问题是该工艺要求功能菌株具 有耐高温 （ ４５ ℃ 以上能生长繁殖 ） 、 高产酒精 （ 酒糟再利 用的经济价值 ） 和风味物质 （ 良好的酒质要求 ） 的特性。
酿酒科技
２００８ 年第 ７ 期 （ 总第 １６９ 期 ）・ ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００８ Ｎｏ．７（Ｔｏｌ．１６９）
２３
Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ 技术选育高耐性酿酒酵母
陆筑凤 １， 李
（ １． 贵州大学生命科学学院 ， 贵州 贵阳
超 ２， 王昌禄 ３， 龚国利 ３， 郭坤亮
（１． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ， Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５００２５； ２． Ｈｕａｒｕｎ Ｘｕｅｈｕａ Ｂｅｅｒ Ｃｏ．Ｌｔｄ．， Ｌａｎｇｆａｎｇ， Ｈｅｂｅｉ ０６５２０１； ３． Ｌａｂ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ ｏｆ ｖｉｔａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｕｓｅ ｏｆ ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ＇ｓ ｇｒａｉｎｓ ｏｆ Ｍａｏｔａｉ Ｌｉｑｕｏｒ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ＵＶ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｆｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｈｕｆｆｌｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｂｙ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｆｕｓａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ＹＥＰＤ ｐｌａｔｅｓ． Ｆｉｎａｌｌｙ， ｎｅｗ ｓｔｒａｉｎｓ， ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｔ ｕｐ ｔｏ ４６ ℃ ａｎｄ １６ ％ｖｏｌ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｉｔｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ７ ％ ａｎｄ ３３ ％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎ－ ｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｉｓ ｆｕｓａｎｔ ａｔ ３０ ℃ ｒｅａｃｈｅｄ ａｔ １３．８７ ％ｖｏｌ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｅｓｔｅｒｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ０．６３７ ｇ／Ｌ ａｎｄ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｎｄｅｘｅｓ ｒｅａｃｈｅｄ ａｔ ５．３０ ％ｖｏｌ ａｎｄ ０．３１３ ｇ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ４２ ℃． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｅ； ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ； ｅｔｈａｎｏｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ； ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ； ｃｈａｒａｃｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ