荧光法和总复习

镁-Oxine Oxine的激发光谱和发射光谱
/
荧光分析法测定血清中的镁
荧光光谱的特点
Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰 位移到较长的波长. 位移到较长的波长 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜 像对称关系.
第 9章 作 作业
思考题3，思考题4
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期末总结
一、络合、氧还、沉淀溶解平衡的 基本知识 二 滴定分析方法 二、滴定分析方法 三 重量分析法 三、重量分析法 四、吸光光度法
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一、络合、氧化还原、沉淀溶解 、 、 、 平衡的基本知识
络合滴定中 的平衡关系
Ka Ki
能准确滴定 6 突跃范围 Et
( 1Ө 2Ө ) p 0.059
36
沉淀溶解平衡处理思路 沉淀溶解平衡处 路
MmAn mMn+ + nAmOH L H MOH ML HA
条件溶度积 Ksp
对MA2
Ksp =[M [M ]m[A ]n = Ksp·Mm·An 由Ksp计算溶解度 计算溶解度：以 以MA为例 MA均不过量时： S=[M ]=[A ]= 当M过量时： S=[A ]= K /[M ] sp 当A过量时： 过量时 S=[M ]= Ksp/[A ] p K sp
αY(H)
[H] βi [A]
lg(csp·K')
K(MY) K(MIn)
αM αIn(H)
K'(MY)
±0.1% 0 1% c(M) c(M)
+ (pM') sp
- lgαM
±pM
(pM) sp
lg(c c·K K')
c(A)
K'(MIn)
(pM') ep
pM
Et
查表得(pM) t= (pM) ep
2
一份符合朗伯-比耳定律的有色溶液，当 溶液中有色物质的浓度增加时 以下参数 溶液中有色物质的浓度增加时，以下参数 如何变化？ (A) 最大吸收波长（max） (B) 吸光度（A） (C) 摩尔吸光系数（ ）
3
朗伯-比尔定律
A= b c
1·cm-1 1) =A/bc (L·mol-1
9.1.2 荧光与分子结构的关系
1. 跃迁类型 激发
*, , n *
* , * n
发射
*跃迁的 大100 与 n *跃迁相比， ~ 1000倍，寿命较短，通过系间窜跃至三重 态的速率也较小，因此 * 跃迁的荧光 效率较高。
2. 共轭效应 →* 跃迁
荧光现象的发现
10
发光机理(Jablonski Diagram)
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
分子吸光与发光示意图
蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:ex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em
例如：荧光光度法测定铁
方法示例 1：
方法示例 2：
方法示例 3： 基于铁( Ⅲ) 对荧光试剂邻苯二酚的荧光猝灭, 建立了测定微量铁的
荧光分析方法。在0. 3mol/ L的HCl 介质中, 最大激发与发射波长分别为277 nm 和 313 nm, 荧光强度与铁的浓度呈良好的线性关系, 测定铁浓度的线性范围为 1. 59×10-5 --1. 1. 26×10-3mol/ L, 检出限为7. 14×10-6mol/ L, 常见的共存离子不干扰 测定。本方法用于环境水中铁( Ⅲ) 的测定, 结果满意。
吸收物质在 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征 定波长和溶剂条件下的特征 常数； 不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在 温度和波长等条件一定时， 温度和波长等条件 定时，ε仅与吸收物质 本身的性质有关。 反映了光度法测定该物质可能达到的最大 灵敏度 灵敏度。
4
朗伯-比尔定律的分析应用
9 1 4 荧光光度计及荧光分析法的应用 9.1.4
激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光， 见光 续发光
光 源 激发光 单色器 激发 荧光 样品池
常用氙灯、高压汞灯或激光光源. 样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两组光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的 方向检测荧光.
I0 F
测定方法
I0 F It
灵敏度高：测定下限0.1～0.001 µg·mL-1, 比分光光度法高2～4个数量级. （在黑背景下检测；光源的强度大）
荧光测定的选择性
蒽
菲
蒽的激发和发射光谱
菲在360 nm以上无吸收，用 以上无吸收 用 365 nm激发光时，菲无荧光， 可以在400 00 nm测定蒽的荧光. 在265 nm, , 蒽和菲均有吸收， 以此波长的光激发，在350 nm 只有菲有荧光，故可测定菲.
配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A. HL [H+] c(HL) L K a c(HL) A= HL [HL]+ L [L] = + + K a +[H ] K a +[H+]
K
a
=
AH L - A
A- A
L
Hale Waihona Puke [H + ] 或 pK a = pH + lg A
A- A L
HL-
溶液浓度的测定
A
A＝ b c
工作曲线法 (校准曲线)
0.80 Ax 0 60 0.60 0.40 0.20 0.00
*
cx 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
5
浓度测 浓度 量的相 对误差 与 T( 或 A ) 的关系
Er
10 8 6 4 2 0 20 0 0.7 (36.8) 40 0 0.4 0.434 60 0.2 80 0.1 T/% A c 0.434T Er c T lg l T ( T 0.01)
A
[HL]
7
MO吸收曲线
曲线 1 2 3 4 5 6 pH 1.10, 1.38 2.65 3.06 3.48 3.98 5.53,6.80
A
1 2 3 4 5 6
Aa(HL)
Ab 6
5 4 3 2 1
由每份溶液的一 对pH、A，可求 可求 得一个Ka, 取平 均值即可.
Ab (L) 550 600
8
350
Aa 400 450 500
/nm
第9章
9.1 分子荧光和磷光分析法
9.1.1 光致发光的基本原理 9.1.2 分子光致发光与结构间的关系 9.1.3 荧光强度的影响因素及测定步骤 9.1.4 荧光（磷光）光谱仪 9.1.5 荧光和磷光分析法的应用
9
9 1 1 光致发光的基本原理 9.1.1
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚 取代基之间若发生氢键 增强分子平面性和刚 性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH 中性、碱性 均有荧光
OH OH 无荧光 碱性 有荧光
9.1.3 荧光分析法的定量基础和条件控制 1. 荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系
在稀溶液中： F＝2.3Kφεb cI0＝2.3KφAI0 φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
实际工作中，应控制T在10～70％, A在0.15 0 15～1.0 1 0之间 (调c, b, b )
6
7.5.5 一元弱酸解离常数的测定
HL H＋＋L
HL、L 颜色不同
Ka＝[H+][L]/[HL]
高酸度 高酸度下，几乎全部以 几乎全部以HL存在，可测得 存在 测得AHL＝εHL·c(HL)； 低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL ＝εL·c(HL). 代入整理： [L]
无荧光
OH O—
有荧光
高浓度时，荧光物质发生自熄灭和 自吸收现象，使F与c不呈线性关系
FF
cc 一般当εb c 0.05 时, F 与c呈线性关系
测定方法—标准曲线法
1 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)； 1. 2 确定适宜的条件: 试剂浓度， 2. 试剂浓度 pH，T，t 等； 等 3 以标准溶液作工作曲线； 3. 以标准溶液作工作曲线 4 测未知样的荧光强度(F), 4. ) 根据工作曲线计算 荧光物质的浓度.
荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子（Mg 无机离子 g2+、Al3+、Zn2+、Be+等 等）可同试剂形成荧 试剂 光络合物.
• 荧光熄灭法测定猝灭剂
Ni2+对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+ (6×10-5 ～6×10-3 g g·mL mL-1)
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氧化还原平衡处理思路 p2Ox1+p1Red2 = p2Red1+p1Ox2
n1 1Ө n2 2Ө n1 n2
1 Ө 2 2
盐效应 酸效应 络合 沉淀
1Ө
sp
lg K
3 0.059 还 n(还） 0.1％：Ө 氧 - 3 0.059 n(氧） 0.1% : Ө
菲和蒽的荧光光谱 （激发波长 265 nm)
选择性高： • 适当选择激发光的波长和荧光测定的波长； • 应用荧光寿命的差别 ––时间分辨技术.
荧光光度法的应用
生物化学分析，生理医学研究，临床检测. • 直接测定能产生荧光的物质.
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸.