基因工程抗体
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。
基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。
基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。
这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。
2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。
这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。
3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。
这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。
4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。
这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。
基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。
2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。
3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。
4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。
基因工程抗体
第五章基因工程抗体分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。
抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。
自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。
异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。
随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
第一节免疫球蛋白概述免疫球蛋白（immunoglobulin）是指具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。
它是介导体液免疫重要的免疫球蛋白分子。
免疫球蛋白可作为B细胞表面跨膜受体，参与膜信号转导，促进B细胞的激活、分化及凋亡。
血浆中分泌型抗体，具有中和抗原、激活补体或介导细胞毒作用等功能。
一、抗体的生成理论侧链学说( Side chain theory)，模板学说(Template theory )，克隆选择学说(clonal selection theory)二、抗体的结构1、轻链与重链Ig分子由两条轻链（light chain,L）和两条重链（heavy chain, H）组成。
轻链的分子量约为24kD，重链的分子量约为55kD或77kD。
轻链的种类有两种，即κ和λ。
基因工程抗体的例子
基因工程抗体的例子
基因工程抗体是通过基因重组技术将特定抗体基因导入至其他生物细胞中，使其具备产生抗体的能力，从而实现大规模生产高效、高纯度的抗体。
以下是一些基因工程抗体的例子：
1. 重组抗体药物：例如，重组人源单克隆抗体药物，如阿达木单抗（Adalimumab）和帕尼单抗（Panitumumab），用于治疗自身免疫疾病和某些癌症。
2. 基因工程抗体治疗疫苗：例如，COVID-19疫苗中使用的mRNA 疫苗，通过基因工程技术将病毒的抗原编码序列导入到人体细胞中，诱导免疫系统产生抗体来抵抗病毒感染。
3. 重组抗体诊断试剂：例如，基因工程技术可用于生产特定病原体抗体，如新冠病毒SARS-CoV-2抗体，用于开发快速诊断试剂盒，帮助早期检测和诊断疾病。
4. 基因工程抗体治疗：例如，CAR-T细胞疗法，通过基因工程技术将患者自身T细胞中的受体基因改造，使其能够识别和杀死癌细胞，用于治疗某些血液恶性肿瘤。
5. 基因工程抗体生产：基因工程技术可用于大规模生产特定抗体，如重组人源单克隆抗体，用于研究和治疗领域。
这些基因工程抗体的例子说明了基因工程技术在抗体研究、生产和
应用中的重要性和广泛应用性。
抗体的人源化
18
五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
Page 19
19
多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
6
Ig分子的结构模式图
Page 7
7
原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
Page 8
8
一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
Page 16
16
（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
基因工程抗体
VH和VL是抗原决定簇结 VH和VL是抗原决定簇结 合位点 高变区 HVR 决定簇互补区CDR 决定簇互补区CDR 骨架区FR 骨架区FR CH1和CL：Ig同种异型 CH1和CL：Ig同种异型 的遗传标志 CH2： CH2：补体结合位点 CH3：某些细胞Fc受体 CH3：某些细胞Fc受体 Fc 结合部位
Ag
ScFv应用 ScFv应用： 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系
三、单域抗体 抗体与抗原的结合主要由Ig 抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定， Ig的 区决定， 因此只含V区基因片段的小分子抗体， 因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只 有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单 VH或 VL一个功能结构域 一个功能结构域， 克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段 克隆抗体的特异性。 就称为单域或单区抗体， 就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个 Ig分子的 12，故也称之为小抗体。 Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。 分子的1
双特异性抗体的特点
* 将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤 部位的效靶比。 * 不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的 杀瘤机制。
2 1
3
提高抗体效应功能
双特异性抗体 抗体融合蛋白
提高抗体 效应功能
细胞内抗体
偶连细胞毒物质
抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代， 抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，
基因工程抗体
四.超变区多肽
抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来 实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小 结构单位。根据这一特点，可以设计出那些 在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多 肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的 结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为 超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal recognition unit, MRU)。
如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体
单克隆抗体
来源 动物免疫血清、恢复期病人血 多为鼠源性 清或免疫接种人群
特点 来源广泛、制备容易
纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应
组成 针对不同抗原表位的抗体的混 针对单一表位，结构和组成高度
HV sequences contact the antigen.
epitope
Ig胚系基因结构特点
在Ig分子多肽 链中，κ型、λ 型轻链和Ig的 重链分别写作 Igκ、Igλ和IgH ，基因依次写 作IGK、IGL和 IGH，其分别 位于第2、22 和14号染色体 上。
13
重链: 位于14号染色体，可分为4组
甚少 3.生产成本高,难于普及应用
人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、 建株难、不稳定、产量低、人体不能随意 免疫
新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又 尽量保留原有的抗体特异性。
基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基 因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白 基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细 胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌 合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体 融合蛋白和双特异性抗体。
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体是由人工合成或修改的基因来产生的抗体，也称为重组抗体。
与传统的抗体不同，基因工程抗体不受限于动物来源，可以通过人工合成的方式来获得。
基因工程抗体的制备过程包括选择目标抗原、构建重组抗体基因、转染宿主细胞、高效表达和纯化等步骤。
因为基因工程抗体可以定制化地设计和制备，具有高度特异性和亲和力，因此在生物医学研究、临床诊断和治疗等方面具有广泛的应用前景。
常见的基因工程抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和重组抗体等。
其中，单克隆抗体是指由单一克隆细胞产生的抗体，具有高度特异性和一致性；人源化抗体是将动物源的抗体人源化，避免了人体免疫系统对异种抗体的攻击；嵌合抗体是将两种或以上不同来源的抗体结合起来产生的新型抗体，具有更广泛的抗原覆盖范围和高亲和力；重组抗体则是根据目标抗原的结构和性质，设计并合成新的抗体基因来产生新型抗体，具有更高的特异性和亲和力。
基因工程抗体的发展将会在生物医学领域带来更多的应用和发展机会，同时也将推动基础研究和药物研发的进步。
生物技术制药：抗体工程制药(2)
（4－3）小分子抗体
➢ 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
➢ 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的 V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/801/3。
单区抗体
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab片段抗体：VH+CH1
(2)FV抗体：VH+VL
(3)单链抗体：VH-Linker-VL
➢ Herceptin(贺赛汀):针对HER-2/neu原癌基因产 物的人/鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2受体过 度表达的乳腺癌细胞
（2）改型抗体（人源化抗体）
1. 将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植到人 抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移 植抗体。
重构抗体 (Reshape d Antibody)
(4)单域抗体：VH或VL
小分子抗体有很多优点: ➢ 可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; ➢ 分子小，穿透力强; ➢ 不含Fc，没有Fc带来的效应; ➢ 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; ➢ 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒
素或酶标抗体等。
(１)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进 入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。
➢ 人源性可达90主体 地位。
➢ 目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法
问题
➢ 改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/40 ➢ 亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于
临床的重要因素 ➢ 人Ig分子的框架区一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不
协调 ➢ 三维蛋白结构等需进一步丰富
基因工程抗体
展望
基因工程抗体由于将抗体基因置于人的操作之 下，抗体分子的大小、亲和力的高低、对细胞 毒性的强弱，以及是否接上其它有用的分子等 都可根据治疗和诊断的要求进行设计，这是杂 交瘤技术所不及的，因此有着强大的生命结束仅依靠免 疫获得抗体的状况。
用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用 半抗原分子带有一肽键。且通过羧酸根及仲胺 基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连 接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体，在金 属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体 酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键， 其转化数达6×10－4。
4．基因工程抗体技术
催化抗体（catalytic antibody）
催化抗体也叫抗体酶（abzyme），是具 有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗体 的高度选择性和酶的高效催化性
1986年Lerner和Schultz两个研究小组研究已取得了相当 广泛的成功。
在亲和性和结合特异性方面，抗 体－抗原的相互作用与酶-底物的 相互作用相似。
抗体与处于稳定、低能构型的抗原作用，而酶 与处于不稳定、高能的过渡态底物结合。酶结 合能量帮助打开底物分子的化学键。
抗体酶的结构应该与底物过渡态互补。但这种 过渡态往往只存在短时间，所以研究者必须先 制备底物过渡态的稳定低能类似物，然后制备 抗体酶。
优点
这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋 白的免疫原性较低；在血清中比完整的 单克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清 除；无Fc片段，体内应用时可避免非特 异性杀伤；能进入实体瘤周围的微循环 等优点。
（四）Ig相关分子
原理：可将抗体分子的部分片段（如V区 或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
基因工程抗体和抗体工程
2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。
基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。
基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。
人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。
具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。
通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。
基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。
肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。
自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。
疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。
抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。
载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。
转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。
抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。
抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。
B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。
基因工程抗体
由一个仅识别一种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。
其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。
单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。
基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA 重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。
该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。
当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。
融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括B 淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。
一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb 的杂交瘤细胞。
其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。
（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。
经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。
HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。
第三章 人工抗体的制备
h
9
五、单克隆抗体的应用
（一）在血清学技术方面。
（二）在免疫学基础研究方面。
（三）在肿瘤治疗方面。如生物导弹。
（四）在抗原纯化方面。
h
10
第三节 基因工程抗体
一、概念： 利用基因工程技术制备的抗体分子，称为基因工程抗体。这是分子水平的抗体。
优势：去除或减少 无关结构，保留或 增加天然抗体特异 性和生物学活性。
五、全套抗体基因库
h
15
第四节 催化抗体
一、概念： 是具有催化活性的免疫球蛋白，也叫抗体酶。具有抗体的高度选择性和酶的高效催化性。
优点： 具有抗体的高
度选择性和酶的高
效催化性。
h
16
二、催化抗体的制备：
如：细胞融合法、基因工程抗体技术、引入辅助因子法等。
三、催化抗体的应用：
如：在抗肿瘤方面的应用。在戒毒上也有重要应用价值。
h
17
h
11
基本制备过程：
h
12
一、嵌合抗体：
是指在同一抗体分 子中含有不同种属来 源抗体分子片段的抗 体。
嵌合抗体多为“鼠-
人”类型。
h
13
二、重构抗体：
将鼠抗体超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区编码基因中，再将 此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，转染杂交瘤细胞，并表达嵌合的V 区抗体。
三、单链抗体：
单
需适当选择 产生高纯度抗体
无 悬浮培养：0.01~0.05
中空纤维： 小鼠
体外培养液：无7
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体生产基本过程
h
8
四、单克隆抗体的优势
高度均一性： 纯度很高的均一性抗体
高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应。
31第3.3章基因工程抗体的制备一
（2）可变区片段(variable fragment, Fv)
定义： 是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能性片段，是由轻链和重链可
变区以非共价键结合而成的单价小分子，其大小为完整抗体的1/6。
（3）单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)
（2）改形抗体(reshaped antibody, RAb)
定义：为进一步降低抗体的免疫原性，应用基因工程技术将 鼠源McA b中CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体 CDR，即为“CDR植入抗体(CDR grafting antibody)”。
（2）改形抗体(reshaped antibody, RAb)
3
基因工程抗体的优点
降低甚至消除人体对鼠单抗的排斥反应 分子量较小，易进入病灶的核心部位 可根据治疗需要制备新型抗体 可采用多种表达形式，大大降低生产成本
Hale Waihona Puke 一、人源化抗体定义：是指利用DNA重组技术对鼠源的McAb进行 改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所取代而 获得的抗体。
一、人源化抗体
特点： 保持鼠源单抗的特异性和亲和力 几乎对人体无免疫原性
二、小分子抗体
定义：是指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。 优点：
分子量小，易到达靶部位，可用于免疫治疗 可在大肠杆菌等原核细胞中表达，降低生产成本 免疫原性比原来的单抗弱 不含Fc段，更能集中到达靶细胞部位，有利于作为
特点： 分子量小 稳定性高 免疫原性弱 组织穿透力强
思考题
PD-1抗体是当前研究的热点，目前各公司制备的PD-1抗体是 否是基因工程抗体？为什么？
特点： 降低对人体的免疫原性 保留单抗的特异性和亲和力
基因工程抗体的定义及种类
基因工程抗体的定义及种类
基因工程抗体是通过基因工程技术手段，将人工合成的抗体基因导入到生物体中，使其能够产生特定的抗体蛋白。
基因工程抗体具有高效、可定制、可扩展的特点，被广泛应用于生物研究、医学诊断和治疗等领域。
根据抗体来源的不同，基因工程抗体可以分为以下几类：
1. 全人源抗体：完全由人类基因编码的抗体，与人体内自然产生的抗体非常相似，因此具有较低的免疫原性和较高的亲和力，被广泛用于治疗人类疾病。
2. 人鼠嵌合抗体：将人源的可变区（variable region）基因与
小鼠的恒定区（constant region）基因组合，形成具有人源可
变区和小鼠源常变区的抗体。
这种抗体在结构上更接近于人体抗体，可以减少免疫反应。
3. 草鼠抗体：有时称为小鼠源抗体，是最早被研究和开发的基因工程抗体。
草鼠抗体的可变区与小鼠相同，常量区与人类相似。
尽管草鼠抗体具有较高的免疫原性，但其广泛用于研究和诊断领域。
4. 单特异性抗体：这是由单个抗体链变体或人工构建的抗体基因克隆产生的抗体。
与完整抗体相比，单特异性抗体更小，更便于制备和改造，广泛应用于研究和临床领域。
5. 二抗（二抗体）：由两种不同的单克隆抗体通过基因工程技
术合并而成，具有双重特异性。
这种抗体可用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
总的来说，基因工程抗体的种类非常丰富，每一种都具有特定的特点和应用价值。
随着基因工程技术的不断发展，未来还会有更多新型的基因工程抗体涌现。
基因工程抗体
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
克隆可变区基因的方细胞的mRNA中扩 增VH及VL基因。
同一抗体的两个抗原结合部分分别针对两个不同 的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能 是单价的。
－可介导标记物与靶抗原的结合 －使某种效应分子定位于靶细胞 －可提高抗体的某些生物学效应 －减少抗体的体内非特异性分布
增强抗体效应功能
细胞内抗体（intrabody）
在抗体基因的N端或C端加入引导序列使抗体表达定 位在亚细胞部位，如胞质、线粒体、内质网或细胞核 部位。在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为 细胞内抗体或内抗体。
IgG2、IgG4
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
表达系统的选择
大肠杆菌、噬菌体 无糖基化功能
酵母菌 Asn-X-Ser/Thr 糖基化错误
哺乳动物细胞表达系统 最常用的表达体系
表 达 载 体 的 构 建
共转染模式和单载体转染模式
真核表达载体的要求
为保证PCR产物的准确性，应尽量采 用引导肽部分的引物。
克隆可变区基因常用的引物
克隆鼠κ轻链可变区所用的部分引物
克隆鼠重链可变区所用的部分引物
克隆可变区基因的操作流程
杂交瘤细胞
单链cDNA分离
RNA提取试剂盒
H链引导肽引物 /恒定区引物
L链引导肽引物/ 恒定区引物
制备总RNA
第一链cDNA合成试剂 盒
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗 原 表 位 导 向 选 择
《基因工程抗体》课件
通过基因工程技术改进抗体的稳定性、半衰期等特性，实 现抗体药物的长效化，减少给药频率，提高患者依从性。
基因工程抗体面临的挑战与机遇
免疫原性
基因工程抗体的免疫原性是一个重要问题，需要加强研究以降低免疫 原性，提高安全性。
生产成本
基因工程抗体的生产成本较高，需要进一步降低生产成本，提高可及 性。
《基因工程抗体》 PPT课件
目 录
• 基因工程抗体的概述 • 基因工程抗体的技术原理 • 基因工程抗体的应用实例 • 基因工程抗体的未来展望
CHAPTER 01基因工程Βιβλιοθήκη 体的概述基因工程抗体的定义
基因工程抗体是指利用基因工程技术，通过重组DNA或RNA技术制备的 抗体分子。
基因工程抗体可以针对特定抗原或抗体，通过体外基因操作和表达，获得 具有特定结构和功能的抗体分子。
基因工程抗体的制备流程
01
抗体基因的克隆
从免疫小鼠的脾细胞中提取抗体 基因，经过PCR扩增后，将目的 基因片段插入到载体分子中。
02
抗体基因的表达
03
抗体蛋白的纯化
将重组载体导入到宿主细胞中， 通过培养和筛选，获得能够表达 目标抗体的细胞株。
从表达抗体的细胞培养液中分离 出抗体蛋白，经过层析等手段进 行纯化。
监管政策
随着基因工程抗体的快速发展，监管政策也需要不断完善，以确保安 全性和有效性。
机遇
基因工程抗体在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病等领域 具有广阔的应用前景，为患者提供更多治疗选择。
基因工程抗体的发展前景与展望
肿瘤免疫治疗
基因工程抗体在肿瘤免疫治疗 领域具有巨大潜力，未来将有 更多针对肿瘤相关抗原的抗体
治疗方案。
基因工程抗体的定义及种类
基因工程抗体的定义及种类一、基因工程抗体定义基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行克隆、表达和纯化，产生的具有高度特异性和稳定性的抗体。
与传统抗体相比，基因工程抗体具有更高的特异性和亲和力，并且可以克服传统抗体生产中的一些限制，如产量低、批次间一致性差等问题。
二、基因工程抗体种类1.单克隆抗体单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是通过杂交瘤技术产生的单一特异性抗体。
杂交瘤技术是将免疫后的B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，形成的杂交瘤细胞具有分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆，可以得到具有所需特性的单克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，广泛用于治疗、诊断和科研等领域。
2.多克隆抗体多克隆抗体（Polyclonal Antibody）是来自免疫后的动物血清或脾脏组织的混合抗体。
多克隆抗体的制备相对简单，适用于大规模生产。
但是，由于是多克隆抗体，其特异性不如单克隆抗体高。
多克隆抗体通常用于基础研究和临床诊断等应用。
3.人源化抗体人源化抗体（Humanized Antibody）是通过基因工程技术将鼠源单克隆抗体的可变区基因插入到人抗体基因中，形成嵌合抗体基因，然后将嵌合抗体基因转染到人类细胞系中表达产生。
人源化抗体的免疫原性较低，可以在人体内保持较长时间的活性，并且副作用较小。
人源化抗体适用于治疗和诊断等领域。
4.功能化抗体功能化抗体（Functionalized Antibody）是通过基因工程技术对抗体可变区基因进行改造，引入新的功能基团或其他蛋白质，使其具有新的功能。
功能化抗体可以在保持原有抗体的特异性和亲和力的基础上，增加新的治疗或诊断功能。
例如，可以引入酶活性基团，使其具有细胞毒性作用；也可以引入荧光基团，使其具有荧光示踪功能。
功能化抗体在肿瘤治疗、自身免疫性疾病等领域具有广泛的应用前景。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
双特异性抗体研究
摘要：靶向肿瘤相关抗原与免疫效应细胞表面触发分子的双特异性抗体，可高效地将体内的免疫效应细胞富集于肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而起到治疗肿瘤的目的，是目前肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。
单链双特异性抗体(scBsAb)是目前比较有临床应用前景的一种小分子基因工程抗体，是在DNA水平上把编码不同单链抗体(scFv)片段的基因通过一段域间连接肽(interlinker)连接起来，直接表达成单链的双特异性抗体分子。
由于不同特异性的抗体片段之间为共价连接，稳定性好，可以在各种表达系统中稳定表达。
已有许多不同的氨基酸序列作为interlinker用来构建scBsAb。
一、双特异性抗体的制备方法
早在单克隆抗体出现前，人们就已经知道双特异性抗体。
最早具有双特异性的抗体出现在1961年，是将两种不同特异性的多克隆抗体的Fab片段混合物经过温和氧化而制备的。
双特异性抗体的制备方法有以下几种：
1.化学偶联法：
在体外用化学交联剂如SPDP、DTNB、O-PDM等可将两种不同特异性的mAb或抗体片段通过二硫键或硫醚键连成双特异性抗体，同时设法避免链内或错配二硫键的产生。
该方法不需要细胞融合，制备简便迅速，产物易纯化。
但操作中难免由于改变抗体的抗原结合部位结构而破坏其活性。
目前，对交联剂本身的致畸、致癌性尚未有确切报道，该类BsAb 较多在体外用于基础研究、细胞毒性观察和特异性的鉴定。
有报道用O-PDM将三个不同特异性的Fab片段交联从而构建成三特异性抗体。
2.双杂交瘤法：
广发应用的双特异性抗体生产方法是在二次杂交瘤中共表达两种不同特异性的mAb。
但是，共表达两种不同的mAb会产生九种不需要的轻、重链配对产物，有活性的双特异性IgG大约占10-50%。
而且，从这些结构相似的抗体中分离纯化目的蛋白也费时费力。
另外，多倍体的杂交—杂交瘤细胞稳定性差，若想连续获得BsIgG，必须经常进行克隆，以保持两套基因的完整。
由于人源杂交瘤尚未取得突破性进展，鼠源抗体作为异种蛋白，会引起HAMA反应，易被人体清除。
尽管如此，到现在，已有至少5种由二次杂交瘤所分离纯化的BsIgG在进行小规模的临床试验。
3.基因工程法：
利用基因工程技术，以抗原结合片段如Fab、Fv为构件设计制备的BsAb，具有分子量小，组织穿透力强，易于清除的特点，并由于缺乏恒定区，减少了与表达Fc受体的细胞发生非特异性结合的机会。
利用可变去两侧5'端框架区和3'端连接区的保守序列设计引物，从杂交瘤克隆细胞中分离纯化总RNA，利用RT--PCR可获得抗体可变区基因。
利用特异性抗原对B淋巴细胞DNA库筛选，或利用探针从杂交瘤细胞或免疫脾细胞的DNA库中筛选以及用PCR法直接扩增，均可获得可变区基因。
随着scFv技术的成熟，有不同的方法可将两种scFv连接构成小分子的双特异性抗体。
二、双特异性IgG的研究进展
1998年。
Merchant等应用了新技术来制备BsIgG，这种方法基本上排除了抗体轻、重链的错配。
应用基因工程的方法改造重联，使之更倾向于形成异源二聚体可以有效地降低重链间的错配，而应用相同轻链来构建BsIgG彻底解决了轻链的错配问题。
1.改造抗体重链使其形成异源二聚体
人IgG分子中蛋白--蛋白相互作用最强的部位是重链C H3区域，而C H2区域是通过其相连的碳水化合物才发生相互作用的。
C H3区域决定了抗体重链间的交联，因此，改造C H3区域，可以使之更易于形成异源二聚体。
改造的指导原则是互补结合。
改造的策略包括：①knobs-into-holes；②链间二硫键；③盐键。
2.用相同的轻链来构建BsIgG
原理上，产生重链二聚体的策略也可以用来改造抗体重链与轻链之间的交界面。
Zhu等曾对轻、重链的交界面进行重构加工了功能性diabody异源二聚体的形成。
更加简单的方法是彻底解决轻链的错配。
这就是用含有相同轻链的抗体来构建BsIgG。
这些抗体主要是通过特意的重链来结合不同的抗原。
用使菌体抗体库可以方便地筛选出这些抗体。
通过噬菌体库筛选后，比较结合11种不同抗原的单链抗体轻链可变区序列可以得到含有相同轻链克隆的几率。
所以两种不同抗原特异性组合中具有相同轻链的单链抗体占这些两两组合的绝大部分，55种组合中50种组合都含有相同序列的轻链。
因此，将含C H3区域突变的两种不同重链和一个相同轻链共同转染宿主细胞可以几乎完全排除抗体轻、重链的错配，从而高效生产BsIgG。
三、双特异性抗体触发的效应供功能
将肿瘤相关抗原特异的抗体与具杀伤肿瘤细胞功能的效应细胞表面触发分子特异的抗体偶联构成双特异性抗体，可高效地将体内的免疫效应细胞富集与肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而起到治疗肿瘤的目的。
双特异性抗体介导的细胞毒靶点
许多肿瘤相关抗原被用来作为免疫治疗的靶点。
选择肿瘤抗原时需考虑的方面有：①该抗原在肿瘤细胞上的表达应该具均质性，并且表达量应该足够高，能引发有效的抗体结合；
②该抗原在正常组织中的表达应该是极低的；③该抗原应该是膜结合的，并且暴露在细胞表面。
目前双特异性抗体介导不同免疫效应细胞亚群的杀伤效应功能得到了广泛的研究。
这些效应细胞亚群包括：T细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞和多形核细胞。
近年来，其他的效应细胞类群如树突细胞及红细胞受到关注。