克隆载体表达载体构建详细版

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表达载体的构建方法及其步骤

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

（4）P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选

质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载

基因的克隆、表达载体构建及功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性

方法）

一、基因克隆

★事前三问

a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？

b.这个基因在哪种材料中扩增？

c.材料需要怎么处理？

◎ 实验前准备工作

a.设计引物，准备材料，

b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒

提取试剂盒、连接试剂盒

c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、

Kan+等抗生素准备

※ 基本流程

提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回

收—连接—转化—

涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成

1.1叶片、根总RNA的提取

Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。

1）实验前准备

预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。

2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：

（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

基因克隆载体构建和转化学习PPT教案

电泳检测:
6－10ul 上样即可加Maker（3ul）：分子量是否正确是否有非特异条带(若有,提高退火温度)
电泳及凝胶成像系统操作:
1) 电泳缓冲液倒入专门的广口瓶内 2) 制胶板, 梳子要及时清理 3) 凝胶成像系统操作区为非污染区,勿污染 4) 扫胶后立即关掉紫外灯 5) 图片保存后关掉凝胶成像仪开关 6) 最后关掉电脑
质粒PCR
• 选2-3个菌落PCR鉴定出的菌落 • 5-6ml LB 液体培养基(加Amp,1000倍母液)过夜, 37度培养. • 在超净台各取1ml菌于1.5ml 无菌离心管内于4度保存 • 同时取0.5ml菌液,加入0.1ml无菌甘油,混匀,-40或－80度保存. • 剩余菌液用于提质粒, 用质粒做模板,进行PCR鉴定
双酶切
• 酶切buffer: 平衡两种酶 • 酶切温度: • 酶切时间: 酶切效率 • 酶切体系: 1ul酶/20ul体系
酶切后电泳,回收
• 电泳:更换新的电泳缓冲液 • 胶: 浓度低的胶,厚,上样量尽量多 • 切胶:选准片段, 快,减少紫外注射的时间 • 切胶:尽量去除多余的无样的胶
回收： • 胶要充分溶解， • 注意:EB污染手,枪等 • 用20-25ul 两次冲洗,共得到20ul左右 • 电泳:3－5ul上样，加相同量的Maker,确定浓度
• 侵染： • 收种子：2－3次 • 筛选：收完及时筛选

基因的克隆、表达载体构建及功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）

一、基因克隆

★事前三问

a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？

b.这个基因在哪种材料中扩增？

c.材料需要怎么处理？

◎实验前准备工作

a.设计引物，准备材料，

b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂

盒

c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备

※基本流程

提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—

涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成

1.1叶片、根总RNA的提取

1）实验前准备

2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：

（2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

实验十五、、表达载体的构建

原核表达载体克隆载体: 克隆载体
通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。
表达载体: 表达载体:
除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基，该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。
选择表达载体应考虑的因素
(4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体序列间应有适当的切割识别序列。 (5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才能被表达。
枯草杆菌表达系统枯草杆菌
真核表达系统类型
酵母表达系统酵母哺乳动物细胞表达系统哺乳动物昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒植物细胞表达系统。植物细胞
真核表达系统类型需要有强启动子、增强子、连接序列（内含子）、转录起始信号、转录信号、多聚A信号、翻译起始密码子(ATG)和终止密码子等筛选标记等。
除了上述因子外还需要有强启动子核糖体结合位点核糖体结合位点又称sd序列它是指mrna分子中核糖体结合的序列通常位于翻译起始密码子前面312个碱基该序列与16srrna的互补转录起始信号转录信号翻译起始密码子atg和终止密码子等一系列调控序列

克隆载体与表达载体

1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；

2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。

1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。但是并非T载体不能用来表达。常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。pGEM-T则含有T7和SP6启动子。

2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。

3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。其实这里面大有学问。学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物

1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）

2、根据OD值加DD水。

3、静置30min（冰上）

4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。

5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。

二、跑MIX检测引物（20ul体系）、

上引物0.8ul

下引物0.8ul

Mix 10ul

DNA（日本晴）1ul

DD水7.4ul

三跑高保真酶（50ul体系）

DNAorCDNA 2ul

上引物2ul

下引物2ul

5*buffer 10ul

dNTPs 5ul

DD水28ul

Pfu（最后加）1ul

四胶回收流程

1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。

2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。

3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。

4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。

5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）

6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。

7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。

8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。

五、胶回收产物检测（10ul）体系

上引物0.4ul

下引物0.4ul

Mix 5ul

回收产物1ul

DD水 3.2ul

六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）

胶回收产物 3.5ul

Blunt cloning 0.5ul

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

（4）P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，

构建表达载体的一般流程

构建表达载体的一般流程如下：

1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。

2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。

3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。这些序列将调控基因的表达方式和水平。

4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。

5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。

6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。

7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。

8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。

需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

（4）P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+

（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

（4）P/E 启动子/增强子

(5）Terms 终止信号

（6）加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点.如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体.

【2】。载体的类型:

（1)克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）.如〈10kb 选质粒。

(2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位.

综上所述,选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

(1)选分子量小的质粒，即小载体（1－1。5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

1.一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

2.载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

3.选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；

实验十五、、表达载体的构建

通过构建表达载体，研究基因的功能和表达调控机制。
04
03
实验材料与方法
实验材料
表达载体
质粒或病毒载体，用于在宿主细胞中表达目的基因。
T4 DNA连接酶
用于连接DNA片段和载体，形成重组DNA分子。
DNA片段
用于插入表达载体中的目的基因。
限制性内切酶
用于切割DNA片段和载体，以便将目的基因插入载体中。
04
实验结果与分析
实验结果
成功构建了表达载体pET-32a（+）
通过PCR和酶切鉴定，证实了目的基因已经成功连接到表达载体上。
表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）
将构建好的表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经过抗生素筛选和菌落PCR鉴定，确认转化成功。
目的蛋白的表达
在诱导剂IPTG的作用下，成功诱导了目的蛋白的表达，通过Western blot检测，证实了目的蛋白的表达。
结果讨论
在本实验中，成功构建了表达载体pET-32a（+），并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导了目的蛋白的表达。这些结果表明实验操作正确、方法可靠、步骤合理、转化效率较高，达到了预期目标。
在实验过程中，需要注意实验操作的规范性和准确性，保证实验结果的可靠性和重复性。同时，需要不断优化实验条件和方法，提高转化效率和蛋白表达水平，为后续的功能验证和应用奠定更加坚实的基础。

克隆载体表达载体(课件)PPT课件

克隆和测序等研究。
02
克隆载体的种类和特点
质粒克隆载体
总结词
质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，常用于基因克隆和表达。
详细描述
质粒克隆载体具有自我复制的能力，可以在宿主细胞内稳定存在并遗传给后代。它们通常包含复制起始位点、选择性标记基因以及多克隆位点等元件，便于基因的克隆和表达。
病毒克隆载体
克隆载体的作用
克隆载体主要用于将目的基因在宿主细胞中进行稳定或瞬时的表达，同时也可以用于基因的克隆、测序和基因组分析等研究。
表达载体的定义和作用
表达载体的定义
表达载体是一种能够将目的基因在宿主细胞中高效表达的载体，通常包含启动子、终止子、多克隆位点等元件。
表达载体的作用
表达载体主要用于将目的基因在宿主细胞中实现高效、稳定和可调控的表达，同时也可以用于基因的表达、纯化和功能研究等。
克隆载体与表达载体的关系
克隆载体和表达载体都是基因工程技术中的重要工具，它们在目的基因的获取、克隆、表达和分析等方面发挥着重要作
用。
克隆载体通常用于目的基因的获取和克隆，而表达载体则用于目的基因的高效
表达。
克隆载体可以转化为表达载体，通过添加适当的启动子和终止子等元件，实现目的基因的表达。同时，表达载体也可以作为克隆载体使用，用于目的基因的
04
克隆载体和表达载体的应用

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

（4）P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载