细胞工程-9 染色体工程

（二）动物的单倍体育种
单倍体育种：就是指利用人工的方法进行单性生殖。
不仅能够为研究发育机制提供特殊的途径，而且在 养殖动物的繁育上还有能够创造具有特殊经济价值的单 性群体（如母鸡、奶牛及雄蚕）。
（1）人工单性生殖
人工单性生殖方法主要包括
1）雌核发育（gynogenesis） 2）雄核发育（androgenesis）
2）雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X 射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在、 适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵 子内的精子染色体加倍，而发育成为完全为父本性 状的二倍体。 雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基 因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂 处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论 和育种中都有一定的价值，对YY雄性引起的性别控制等 也有特殊的意义。
1）雌核发育（gynogenesis），俗称假受精，意 指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞 核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失， 胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。
自然界中动物天然存在的雌核发育频率极低。 在一些无脊椎动物和鱼类等存在。
1911年，赫特威氏Hertwig就第一个成功地人工消除 了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。辐 射剂量在极限以下，精子和受精胚胎均正常，辐射剂 量渐增，胚胎存活率下降，继续增加辐射剂量，回复 到正常卵裂 ，胚胎存活率提高。
要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两 个最主要的问题： 1) 人为地使精子的遗传物质失活 2) 雌核的二倍体化
1）精子遗传物质的失活 不同种类的物理辐射和化学药品的处理都可以导 致精子遗传物质的失活。 物理辐射包括γ射线（通常用60Coγ）、X射线和紫 外线。
γ射线（通常用60Coγ）和X射线具有较高的穿透力， 能诱使染色体断裂。 紫外光能诱使胸腺嘧啶二聚化，这一过程能在光作用 下修补复活。
（3）雌核发育的鉴别
经人工或自然诱导的雌核发育个体，需经一定的 鉴定，以证明它确属雌核发育的个体，精子在胚胎发育 中确实没有在遗传方面做出贡献。
鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化 等方面的指标为依据。例如，鲤鱼中，用辐射处理正常 全鳞片鲤鱼的精液，授予具散鳞片类型的鲤鱼卵，获得 100%散鳞片子代，表明为100%的雌核发育个体。
二倍体
多倍体
单倍体
非整倍体
（二）染色体结构变异：
易位translocation：染色体的某一片段移接到另一条非 同源染色体上或同一条染色体上 的不同区域
缺失deletion：染色体上某一区段及其带有的基因一起 丢失 倒位inversion：染色体上某一区段连同带有的基因顺 序发生180度倒转
重复replication：一个染色体上增加了相同的某个片断
通过细胞学的研究能更精确的判别雌核发育。若是 雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体， 否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。
三、动物染色体结构的改造 （一）动物染色体结构的改造的方法
1. 放射线诱导 放射线诱导可以使染色体产生缺失、易位、倒位、 复制及基因内的点突变。 例如， 利用ES细胞诱导产生突变，再将带有突变的
其它药物麻醉剂如N2O和聚乙二醇等。
缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后 的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体 往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法 在实际中的应用不及物理方法。
2) 物理学方法
• 温度休克法：冷休克法（0～5度）和 热休克法（30度左右）。 定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体 或四倍体的方法。 关键：能否成功阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达 到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理 持续时间（D）和处理温度（T）三个因素。以及能否抑 制受精卵的卵裂。 目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般 来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休 克效果较好。
第九章 染色体工程
Chromosome Engineering
纲要：
一、染色体变异
二、动物染色体的倍性改造
三、动物染色体结构的改造 四、人工染色体
一、染色体变异
染色体变异： 在真核生物的体内，染色体是遗传物质DNA的 载体。当染色体的数目发生改变时（缺少，增多）或 者染色体的结构发生改变时，遗传信息就随之改变， 带来的就是生物体的后代性状的改变，这就是染色体 变异。它是可遗传变异的一种。根据产生变异的原因， 它可以分为结构变异和数量变异两大类。
多倍体是由细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制 受精卵第二极体的放出，产生三倍体或抑制第一次卵裂产 生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体:
1) 化学诱导方法：化学物质如细胞松弛素B等常 用的动物多 倍体诱导剂。 2) 物理学方法：包括温度休克法、水静压法和 高盐高碱法等。 3) 生物学方法：杂交尤其是种间杂交获得异源 多倍体。
二、动物染色体倍性改造
染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增 加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动 植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍 体育种和单倍体育种。
（一）动物的多倍体育种
（1）染色体加倍技术
（2）多倍体的倍性鉴定
（3）动物多倍体育种的意义
多倍体 polyploid：每个体细胞含有三个或更多染色 体组的个体，3，4，5，6，8倍 体。在自然界高等植物中较常出 现，而动物界较少。
ES细胞植入小鼠的囊胚，从而产生带有突变 的个体，进一步进行功能的研究。 Thomas等用此方法在小鼠的9号染色体的 Ncam位点，产生了一系列的缺失突变，缺失 的大小都在3cM以下，有的可达35cM,缺失图 谱几乎包括了9号染色体的一半，为研究9号 染色体的功能提供了很好的材料。
放射线诱导产生的突变不能定位，随机发生。
• DNA含量测定（直接法）——流式细胞仪（flow cytomety）是测定DNA含量比较准 确的方法。
• 体积测量——一般，细胞核大小与染色体数目成比例增 加，而且为维持恒定的核质比 例，随着细胞核的、 增大，细胞大小也按比例增加。因此组成多倍体有 机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。但多 倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。（间接 法）例如，鱼多倍体常通过测量红细胞来鉴定其多 倍性。为了更准确地反映倍性常和直接法结合使用。
பைடு நூலகம்
适于大规模生产的。
3）生物学方法
生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多 倍体。 例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂 （2n＝48）杂交可以获得子一代草鲂杂种三倍 体。 这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导 致第二极体不排出，而产生多倍体。
（2）多倍体的倍性鉴定
• 染色体计数（直接法）——是鉴定多倍性的一个准 确的直接方法。质量好的染色体标本可 以从胚胎获得，因为胚胎的分裂指数高。
优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有 利于大规模生产使用。
• 水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制 第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。 这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理 时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。 但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较 高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不
在自然条件和人为条件改变的情况下，染色体结 构的改变和染色体数目的增减，都将导致生物性 状的变异。
染色体工程：按照人们的需要对生物的染色体进行 操作，添加、消减或替换染色体，从 而达到定向选育新品种或创造人工新 物种的目的。动物染色体工程主要包 括染色体倍性改造、结构改造及人工 染色体的利用等技术。
另外，用蛋白质电泳、 通过对血液化学组成成分以及酶 的含量的生化分析也可用于多倍体的鉴定。（间接法）
（3）动物多倍体育种的意义
• 许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等 具有良好的生存力和生长率。
• 低等动物种间杂交优势明显（生长快、具有两个 不同种的优良特性），但成活率较低。 三倍体 可增加种间杂种的存活率。 • 利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能 量用于动物生长…… • 多倍体育种技术方法简单，具有潜在的理论和应 用价值。四倍体与二倍体杂交获得的三倍体与二 倍体存率活率相当。是产生三倍体的好办法。 难点：准确的处理时间、诱导率、成活率、孵化率、倍性鉴定方法 等还未解决
（2）人工诱导雌核发育的方法
人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或γ射 线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间 施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的 排出，使卵子发为正常的二倍体动物。
凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色 体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。
雌核发育的关键问题
loxP （locus of crossing over(x) in p1）的序列特征： LoxP位点是一段含有34个碱基对的序列，其两 端为13bp的反相重复序列，之间有一个8bp的不对称核 心序列，决定 LoxP的方向。
一个线形DNA分子或染色体上有两个同向的loxP位点时， 经 Cre酶作用，位点之间的片段被环化，游离于线形DNA分子 或染色体之外，此时线形分子或染色体和环状分子上各留一个 loxP位点。 ——删除 上述过程的逆向过程就是一种整合的过程。——整合
当所有的基本染色体组都来自同一物种的多倍体称为 同源多倍体(autopolyploid)
染色体组来自不同物种的多倍体称为 异源多倍体(allopolyploid)
。
（1）染色体加倍技术
1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两 栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有 生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以 人工诱导多倍体，改善动物经济性状倍受重视。现 在，该技术已成为低等经济动物育种的主要技术之 一，其成果已经应用于生产实践，取得了明显的经 济效益和社会效益。
2. Cre/ loxP介导染色体重组 Cre/ loxP是一种常用的重组系统。Cre重组酶是 在噬菌体P1中发现的一个38kDa的蛋白质，其名称 来源于cause recombination，它能识别34bp的特异 序列（ loxP ）,介导两个loxP之间的序列发生重组， 此过程不需要任何其他辅助因子的帮助， loxp的位 置和方向不同，Cre重组酶介导形成的产物亦不同， 可以导致染色体的删除/整合、倒位、易位，实现染 色体的定点操作。
化学方法：采用化学物质如 甲苯胺蓝、乙烯尿素 和二甲基硫酸等化学物质消除精子染色体遗传活性。 此外，还可采用显微手术直接除去受精卵雄性原核。
2） 雌核的二倍体化
利用保留卵球第二极体或者阻碍受精卵早期有丝 分裂，都可以实现二倍体化。如前节所述，利用温 度、压力或化学方法可以诱使卵球二倍体化，如冷 休克、热休克、流体静水压、细胞松弛素B等。
(一) 染色体数目变异：
• 染色体组（genome）：一个配子的全部染色体。细胞中的一组非同源 染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是携带着控制一种生物生长 发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组 • 整倍体(euploid)：体细胞内含有完整的染色体组的类型 • 非整倍体（aneuploid）：染色体组内个别染色体数目有增减，使细胞 内的染色体数目不是基数的完整倍数。 • 多倍体（polyploid）：每个体细胞含有3个或更多染色体组的个体，3， 4，5，6，8倍体 • 二倍体(diploid)：具有两个染色体组的个体 • 单倍体(haploid )：体细胞内含有配子染色体数目的个体
1) 化学诱导方法：
有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵 的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。 • 细胞松弛素B cytochalasin 抑制肌动蛋白聚合成微 丝，从而抑制细胞质分裂。是最常用的动物多 倍体诱导剂。 • 秋水仙碱colchicine抑制细胞分裂中纺锤丝的形成， 因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。