69-浅谈蛋白质组学及其发展趋势

浅谈蛋白质组学及其发展趋势

10489028 基础医学院2004级 生物物理专业 刘昭飞

摘要：人类基因组计划的完成宣告了后基因组时代的到来，蛋白质组学作为后基因时代的重要组成部分，正成为科学家们竞相研究的热点。本文简要介绍了蛋白质组学的概念，研究的基本技术以及其应用和发展前景。

关键词：蛋白质组 双向凝胶电泳 质谱

前言:

人类基因组计划（HGP）是美国科学家于1985年率先提出的，旨在利用大规模测序技术,完成全部人类数万个基因,30亿对碱基的序列分析；发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置,破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。计划于1990年正式启动。2000年6月26日是人类历史上值得纪念的一天。人类基因组的工作草图已经绘制完毕并于这天向全世界公布。2003年4月14日完成了基因全图。

然而随着人类基因组计划的完成，科学家们发现越来越多的问题呈现在我们面前。DNA作为遗传信息的载体,但真正细胞生物功能的承担者是蛋白质。对基因的识别远不足以全面认识蛋白质的功能[1]:(1)特定的DNA序列并不一定表示对应的蛋白质,单个基因可以编码多种不同的蛋白———这些差异是通过mRNA转录的替代片段,或通过改变翻译的起始或终止,或通过mRNA翻译过程中不同三联密码的框移而实现,而且DNA序列不足以说明蛋白质的结构功能和细胞学定位。蛋白质比核酸更为复杂,蛋白质合成后经过一系列环境依赖的修饰作用,如磷酸化,糖基化,加乙酰基,泛素化,硫化,以及其他多种修饰方式,发生复杂多样的变化。(2)单纯的DNA 密码子也不能提示蛋白质之间如何互相作用,如何进入细胞网络,如何在细胞器上发挥作用。

(3)事实上,早在DNA/RNA表达发生变化前,蛋白质信号通路的激活就可以迅速导致细胞游走、死亡、转化。这些问题很难从基因组研究水平解决,所以分子医学发展到第三个阶段,蛋白质组学应运而生。

一：蛋白质组学

蛋白质组的概念最早是由Williams于1995年提出[2]。指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因组，即一个细胞，一个组织或个体所表达的全部蛋白质成分。蛋白质概念的提出是基因组的一个逻辑性的发展和延伸。蛋白质组是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。由于同一基因组在不同细胞，不同组织中的蛋白质表达情况各不相同，即使同一细胞，在不同的发育阶段，不同的生理条件甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此，蛋白质组是一个空间和时间上动态变化着的整体。

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，是在人类基因组计划研究发展基础上形成的新兴学科，主要是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成和活动规律。

蛋白质组学研究内容包括：（1）蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western 等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。（2）翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。（3）蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另

外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。（4）对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。

二：蛋白质组学研究的主要技术

蛋白质组学研究主要涉及有两方面的内容：一是研究蛋白质组的组成成分，即表达蛋白质组学；二是研究蛋白质组的功能，即功能蛋白质组学。蛋白质组学研究的支撑技术主要有双向凝胶电泳技术和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术，以及生物信息学技术。

1.双向凝胶电泳技术(2-DE)

双向凝胶电泳技术由O’Farrell等于1975[3]年创立，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离。分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物，构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”，分析特定条件下蛋白质的表达状况，进行蛋白质组差异比较。完整的双向凝胶电泳技术包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS-PAGE、斑点染色、图像捕获和图谱分析等步骤。随着样品制备方案的完善、固相 PH 梯度双向凝胶电泳的应用、染色方法的改进和图像分析软件性能的提高，2-DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率，便于计算机进行图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。

双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。

(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD）蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。

2. 质谱技术[4][5][6]

蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列（称为一级结构）及由肽链卷曲折叠而形成三维（称为二级，三级或四级）结构。目前质谱主要测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛 蛋白质的质谱分析原理

以往质谱(ＭＳ)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。