SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项

合集下载

SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

染色前
实验原理
迁移率= “蛋白质移动的距离”
指示剂移动的距离
L1 X L3
L2 X L4
染色后
Lx
蛋白质的带在哪呢？
L1
L4
L3
L2
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
Marker 97 66
44
29
20 14
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
Tanon-1600数码凝胶图像分析系统
GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00)
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
诱导前后蛋白表达差异
IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
3 “拖尾”现象样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大
解决办法： ➢加样前离心 ➢选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 ➢加增溶试剂 ➢降低凝胶浓度
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
4 “纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的

SDS-PAGE蛋白质胶内酶切

蛋白质胶内酶切步骤

一、溶液准备

考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；

银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠

覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；

酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；

萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；

二、操作步骤

1.水洗胶块2次，吸走液体；

2.胶块脱色。

1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料

洗去，吸走液体；

2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶

块变得完全无色透明；

3.胶块脱水。加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；

分别吸走液体；

4.还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）

1)加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸

走液体；

2)加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液

体；

3)加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；

4)胶块脱水，重复步骤4；

6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul的酶液；

PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明

货号:G7210

规格:1L

保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。

试剂盒内容：G7210

染色液A200ml

染色液B1ml

染色液C100ml

显色液D100ml

试剂E2g

注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。

产品说明:

蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。

操作步骤:

一、染色液配制(无水乙醇自备)

需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。

1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀；

2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀；

3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。

4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。

5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。

二、染色：

1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程

----(纯度检测)一.目的：

检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：

《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：

质量控制部。

四.试剂与水：

所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：

所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：

电泳仪（电源1--300V）

电泳槽

灌胶模具

染色具

凝胶扫描仪

七. 环境要求：

相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：

1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8

称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。贴上标贴，4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

2.B液: 1MTris·HCl pH6.8

称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。贴上标贴，4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

3.C液: 30%丙烯酰胺

称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。贴上标贴，避光4℃保存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

4.D液:10%SDS

称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（非还原还原）

GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE

SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测

起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0

批准：年月日生效日期：年月日

文件分发部门：

GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICE

SDS-PAGE蛋白电泳检测编号：

SDS-PAGE蛋白电泳检测

一目的

保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。

二范围

用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。

三责任

质量控制部人员。

四内容

1试剂与水：

所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

2 溶液的配制

2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8

称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。

6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。

2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8

称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用

6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。贴上标贴，室温储存。

2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液

称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。贴上标贴，避光4℃保存。

蛋白质银染原理与方法

2009-04-28 16:38:24 来源:未知【大中小】评论: 条

摘要：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。

①

SDS-PAGE电泳。注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与Commassie

Blue染色比较，银染加样量要少。否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②

电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。加入25ml Fixing

Solution（固定液），室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25ml

Incubation

Solution（保育液），室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去Incubation

Solution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取2.5ml 10X

Silvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25ml

Silvering Solution (银染液)。室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mL

Developing

Solution（显色液），室温振荡保温1~10min。注意观察目的条带。如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,

加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项

货号：G0180

规格：20T

有效期：6个月有效。

产品内容：

试剂(A):Silver Stain Sensitizer(500×)2×1ml RT

试剂(B):Silver Stain(100×)10ml RT避光

试剂(C):Silver Stain Developer(5×)2×100ml RT避光

试剂(D):Silver Stain Stop Buffer(10×)100ml RT

产品说明：

蛋白快速银染试剂盒(Protein Fast Silver Stain Kit)是一种快速的可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。其优点还在于：1、操作简单、快速；2、可用于2D凝胶的银染，并可进行后续的质谱检测；3、目的条带清晰；4、不含甲醇。Protein Fast Silver Stain Kit与Protein Silver Stain Kit 相比，前者操作速度更快，当检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：

1、水平摇床或侧摆摇床

2、去离子水(超纯)

3、乙醇、冰乙酸

操作步骤(仅供参考)：

1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液

为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水

SDS-PAGE电泳的标准操作规程

SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）

1、目的及适用范围

SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。

2、主要仪器

恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具

3、试剂及配制方法

试剂配制方法或要求

H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm

1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8

30% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）

10% SDS 10% SDS溶液

10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）

TEMED TEMED溶液

1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8

15.1

g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.3

5×电极缓冲液 Tris

2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇

5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇

蛋白质凝胶电泳及染色方法的几点改进

　第19卷第4期安康学院学报 Vol119№4 2007年8月 Journal of Ankang University Aug12007蛋白质凝胶电泳及染色方法的几点改进

陈　芳,陈久存

(安康学院化学与生命科学系,陕西安康725000)

摘　要:S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS-P AGE)及染色技术,是常用测定蛋白质亚基分子量的方法之一,具有设备简单、操作方便和分辨率高等优点1但在操作中,尤其样品较多时,此方法仍然有一些不足之处1通过大量实践,做以下改进:建立根据不同相对分子量的蛋白质快速选择凝胶浓度的方法,并确立解决蛋白质凝胶电泳和染色过程中的常见问题及改进策略1

关键词:S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;考马斯亮蓝染色;蛋白质银染

中图分类号:Q51　文献标识码:A　文章编号:1674-0092(2007)04-0078-03

Severa l I m provem en ts of the Prote i n Gel Electrophoresis and St a i n i n g M ethod

CHE N Fang,CHE N J iucun

(The D epart m ent of Che m istry and L ife-Science,A nkang U niversity,A nkang725000,Shaanxi,China) Abstract:The techn ique of the SD S-PAG E and dye ing is one of com m on ly used m e thods of the D e te r m in ing of p ro2 te in m o lecu la r w e igh t1Th is m e thod has m e rit of the s i m p le equ ipm en t,the ease of O p e ra tion and the h ighe r reso lving ra tio and so on1B u t in the p rocess of op e ra tion,th is m e thod s till has som e defic ienc ies,esp ec ia lly fo r m any sam2 p les1Th rough the m ass ive p rac tices,has m ade fo llow ing i m p rovem en t to th is m e thod:es tab lishes the sp lit-second se lec tion ge la tin dens ity m e thod w ith d iffe ren t p ro te in re la tive m o lecu la r w e igh t,and es tab lishes the so lu tion p ro te in ge l e lec trop ho res is and the dye ing p rocess frequen tly ques tions s tra tegy1

PAGE胶蛋白微量回收试剂盒使用说明

货号：G7200

规格：20Assays

保存：所有试剂常温下运输，收到后所有试剂2-8℃保存，溶液B避免火源，溶液A在低温下容易形成沉淀，请在使用前30℃加热，以促进溶解。

产品组成：

产品名称规格

Buffer A10ml

Buffer B60ml

干粉9.6g

DTT40mg

使用前将干粉和DTT完全溶解于溶液A中，配完后4℃保存，每次使用时30℃加热，以促进溶解，混合好的溶液A尽量在一个月内使用完毕。

产品说明：

SDS-PAGE不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量，而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一，随着蛋白质技术的微量化，有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分析或末端序列测定等，本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法，本产品适用于从考染，铜染或锌染中回收蛋白质，回收效率在50-80%，能够使用20次。

产品特点：

1.简单，不需要复杂而昂贵的仪器（如电洗脱仪）。

2.适用于变性胶（SDS-PAGE）和非变性胶（Native-PAGE）。

3.回收率一般在50-80%之间（跟蛋白质大小，洗脱时间相关）。

4.跟后续的实验兼容，包括1-D、2-D电泳和质谱测序等。

操作步骤：

1.用手术刀片将铜染或锌染的胶块中含有目的条带的部分胶切下，放入1.5mL的

离心管中，用相应的消除液将胶中蛋白质条带脱色到胶体接近无色，室温12000rpm （12830g），离心5min，尽量去除上清，保留胶体。

对于考染或其他考染方法，直接将不需要脱色液脱色的或经过脱色液脱色的胶块中含有目的条带部分切下，放入1.5mL的离心管中，用双蒸水洗两次，每次5min，再进行步骤2。

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书

Cat.No：

Lot No：

原理：

本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。

由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。

凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：

1）蛋白质纯度的分析；

2）蛋白质分子量的测定；

3）蛋白质浓度的测定；

4）蛋白质水解的分析；

5）免疫沉淀蛋白的鉴定；

6）免疫印迹的第一步；

7）蛋白质修饰的鉴定；

8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；

9）分离放射性标记的蛋白质。

试剂盒组成：

1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml

2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml

3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml

4．10%SDS 30ml

5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml

6．去离子水250ml

7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml

8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml

SOP SDS-PAGE银染标准操作规程

文件号: QC-SOP-102 Page 1 of 4 Version: A/0 Print Date:

题目：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验流程

目的：为了使员工迅速掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验而编写的操作过程。

范围：成员

负责部门：QC Quality Assurance Department

姓名签字日期起草人：

批准人：

QA：

生效日期：

文件号: QC-SOP-102 Page 2 of 4

Version: A/0 Print Date:

1.概要

1.1 本操作流程用来描述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染的标准操作步骤。

2. 适用范围

2.1本流程适用于操作人员进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染

实验的操作过程。

2.2 本流程适用于在普通实验室中进行操作。

3. 责权

3.1质量保证部门有责任确保操作人员接受过该流程相关实验技术及操作的培训。

3.2质量保证部门有责任确保该流程操作完全按照以下规范进行。

3.3质量保证部门有责任定期检查修订本流程。

4. 材料准备

4.1 试剂和溶液

4.1.1 SDS丙烯酰胺凝胶电泳所需的溶液见SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流

程

4.1.2 固定液30ml甲醇，12ml乙酸，50ml水，50 µl甲醛（100ml）

4.1.3 漂洗液35%乙醇的水溶液

4.1.4 致敏液0.02%硫代硫酸钠的水溶液

4.1.5 银染液0.2%硝酸银的水溶液

4.1.6 显色液6g碳酸钠，50µl甲醛，2ml致敏液，加水定容到100ml

4.1.7 终止液38ml甲醇，12ml乙酸，加水定容到100ml

SDS-PAGE 银染步骤

1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。放于摇床上室温摇动 15 分钟。更换固定液，重复一次。固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1.

3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。

6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。

7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟（我做的时候是孵育45min-1h）。

8. 配制终止液：5%冰醋酸。

9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。

10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。

11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10 分钟。

(注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行)

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作

----(纯度检测)一.目的：

检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：

《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：

质量控制部。

四.试剂与水：

所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：

所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：

电泳仪（电源1--300V）

电泳槽

灌胶模具

染色具

凝胶扫描仪

七. 环境要求：

相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：

1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8

2.B液: 1MTris·HCl pH6.8

3.C液: 30%丙烯酰胺

4.D液:10%SDS

称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为三个月。（溶液配置台帐见附件）

SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳

第一部知识准备

一、双向凝胶电泳

蛋白质组分析的先决条件是蛋白质的分离。分离过程一般可以分为2步，首先将蛋白质消化成肽段，通常由蛋白水解酶完成，然后将复杂的混合物分离成简单地形式。这2步没有明确的先后关系，也可先将蛋白质混合体分离成单个的蛋白质或肽段，然后消化分析。双向凝胶电泳是采取的先分离后消化的方法，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离数千乃至数万个蛋白质的方法，是当今蛋白质组学方法的主流。刚刚兴起的非胶系统蛋白质组学是先消化然后直接质谱分析，充分应用生物信息学方法，是蛋白质组学分离方法的一个发展方向。

(一)双向电泳简介

双向电泳技术建立于20世纪70年代，它的基本原理是首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度介质中等电聚焦（isoelectrofocusing,IEF）将其分离，然后按照其分子量大小在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）进行分离。

目前，根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）、不平衡的pH梯度凝胶电泳（NEPHGE）、固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）。在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度。其主要缺点是在碱性区域不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质；优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于展开工作。各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，利用这一系统可以分辨10000个蛋白质斑点。NEPHGE为非平衡pH梯度电泳，是IPG胶发明之前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电点等电聚焦场中大道平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。在IPG-DALT是现在主要和常用的方法，它的优势表现在：pH梯度稳定、梯度分辨率高；无阴极漂移及碱性蛋白质丢失现象；蛋白质上样量大，可以提高低丰度蛋白质成分的分辨效果；样品中盐的干扰少，无边缘效应；pH梯度和分离效果的重复性好。

SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项

Update:2009-03-15From: Hot: 421

银染注意事项:

1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。

2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。

3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。

4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.

5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。

6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。

7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。

8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。

9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。

10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。

11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。

12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。