免疫组织化学染色存在的问题及解决方案
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
病理诊断中免疫组织化学技术常见问题及改进
高 压高 温修 复效果更 好一些 。应在 达到 预设温 度后维 持 １５— ｉ ． ３ｍｎ为佳 。
２ 脱 片的 常见 原 因及 改进 措施
补体 相互 联接 而 出现非 特异 性 背 景着 色 ， 作 中多见 工
于 冰冻组 织染 色 。
１４ 内源 性生 物 素 一卵 白素 ．
１９ ９４年 Ｃｕｉ ａｌ等 报
定液有不 同渗 透 能力 和 固定作 用 ， 应根 据 需 要进 行 选 择， 常规采用 的是 ｌ Ｏ％ 中性 甲醛 固定 液。浓 度过高 会 阻止 固定 液正 常渗透 ， 度过 低 固定则 不彻底 。固定时 浓
间过长或过 短也是 重要 的影 响 因素。 固定 时 间过 短抗 原没有得到充分保护， 固定时间过长会形成更多的抗原 交联 而影 响抗原 和抗 体的正 常结 合 。所 以建 议小 标本
免 疫组化 的组 织切 片 必须 经 过 高 温 、 高压 或 酶 消
化及 多次洗 涤等步 骤 ， 载玻 片上 因粘 附不 牢而脱 片 。 在
道人 体 唾液腺 导管 上皮 细胞 存 在 生 物素 以来 ， 们逐 人
步认 识 到冷冻 组织 中存在生 物素 一卵 白素 。经 甲醛 固 定、 石蜡包 埋后 的组织 中生物 素 一卵 白素 被封 闭 ， 加热 抗原 修 复可导 致生物 素 一 白素暴 露 。因此一 般采用 卵
脱片受许多因素影响 ， 如载玻片清洁程度与防脱片剂 包被 、 蜡块选择与切片厚薄、 烤片程度与抗原修复等。 ２ １ 载玻 片防脱剂 的包被 干净 的载玻 片是免 疫组化 ．
正 常染色 的前提 和基 础 ， 一般建 议采用新 的载 玻片 。防 脱 剂一般采用 多聚赖 氨酸溶 液 （ Ｅ Ｓ 。由于多 聚赖氨 Ｐｔ ）
免疫组织化学常见问题和解决方法
巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色 内源性生物素的着色
组织在缓冲液（如二甲苯）中 浸泡时间太长 组织变干 不适当的修复方式
较多的切片 如果制片过程中，因丙酮逐渐 挥发而胶变浓时可适当加入一 些丙酮。 加一抗前的血清封闭避免非特 异型的结合
将抗体分装在小管中，冻存于 -20 度，每次使用取一管，避 免抗体反复冻融及交叉污染。 可用过氧化氢封闭去除内源酶 导致的非特异性着色 通过形态学辨认出巨噬细胞
余的缓冲液（但防止切片干燥）
孵育时切片未放平，导致抗体 孵育时，注意切片应水平放置
流失
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过 10 分钟
不适当的标本固定方式
选择合适的固定方法
不适当的抗原修复方式
延长抗原修复时间，或者调整
抗原修复体系，建议参照生产
厂家的说明，同时结合标本的
具体情况来确定
抗体浓度过高
降低抗体滴度（一般只浓缩性
3. 非 特异 性背 景染 色
全片着色
切片边缘着色
“阴阳脸”着色 灶片状着色
少于 60 分钟
抗体孵育时间过短
抗体孵育时间不能少于 60 分
钟
标本中目的蛋白表达量低
查阅文献或数据库，确定组织
中确有目的蛋白强表达。设立
阳性对照片，以验证实验结果
操作中，切片遗留太多冲洗液， 每步滴加试剂前沥干切片中多
导致试剂稀释
免疫组织化学常见问题和解决方法
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组 织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性和分子生物技术的敏感性等巧妙结合，借助显微镜的显像和放大作用，在 细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以 及受体等），是单一的静止的形态学描述，上升到结构、功能和代谢为一体的动 态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。
免疫组化(IHC)常见问题解析
免疫组化（IHC）常见问题解析2162 人阅读发布时间：2020-10-22 15:54免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。
然而理想是丰满的，实际操作起来却是骨感的，作为一种分析方法，常常会存在非特异着色的背景问题。
下图中靶点均为胞膜定位，左边背景着色严重，右边染色效果优良。
01 抗体质量问题抗体本身在靶点设计上如果特异性不够，会导致非特异着色。
一般来说，单抗在特异性上相比多抗是具有优势的，但多抗由于识别任一抗原上的多个表位，多抗可放大低表达水平靶蛋白的信号，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强，可用于非免疫原物种的靶蛋白的检测实验。
具体实验时，还应根据实际需要选择合适的抗体。
另外，抗体保存也应注意防腐及防止反复冻融。
02 内源性酶和生物素当选用肝、肾，脾组织作为样本时，由于这些组织本身含有较高含量的过氧化酶和生物素，对于使用Hrp或生物素-亲和素显色系统的实验都会造成非特异性染色。
对于内源性过氧化物酶，可以用0.9% 的双yang水来灭活。
对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL 亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即可染色。
也可以24 mg/mL 的卵白素封片15 分钟。
03 抗体浓度过高获得良好的染色结果，一般应优化一抗的使用浓度，可参考供应商提供的说明书，但预实验也是必不可少的，摸索出最理想的工作浓度。
04 DAB 染色时间太长/变质DAB 的作用时间过长，同样会造成背景。
DAB 的显色时间不是一成不变的，实验时应及时镜检，出现浅棕色时，马上冲洗。
出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体有效浓度过低。
DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策良好的免疫组化染色切片是正确推断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件特别简单的事。
需要病理技术员和病理医生亲密协作、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音'染色片（有阳性信号）。
一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，消失这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有消失问题，组织或细胞的确不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种状况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
消失这种状况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不行缺少的作用。
（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如，组织未进行抗原修复，有的组织必需经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个渐渐的过，但间或也遇到突然失效的状况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的缘由。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如遗忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避开这种简洁的错误，有一种简洁的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观看是否消失棕色。
假如消失了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
假如这种DAB再滴到切片上没有消失任何阳性信号，问题肯定是出在三抗以前。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
做好免疫组织化学染色的几个注意点
做好免疫组织化学染色的几个注意点免疫组织化学染色是一种常用的方法，用于检测组织和细胞中的蛋白质表达。
在进行免疫组织化学染色之前，需要注意以下几个方面，以确保染色的质量和准确性。
一、样本处理样本处理是免疫组织化学染色的关键步骤之一。
前期的样本处理将直接影响后期染色的效果。
一般来说，样本处理包括取材、固定、脱水、透明化、包埋、切片等步骤。
样本应该在取材后立即进行固定以防止蛋白质的损失和蛋白质异构体的变化。
同时，固定液中的药剂成分要根据不同蛋白质的特性进行选择，不同的药剂成分固定时间也应根据蛋白质的大小和分子量来进行优化调整。
二、抗体选择抗体是免疫组织化学染色的核心。
正确选择适宜的抗体对于染色结果至关重要。
在选择抗体时，应该注意以下几点：1、抗体应具有较高的亲和力和特异性，以确保染色的敏感性和选择性。
2、抗体的来源、克隆和浓度也很重要。
来源纯度应高于90%；与生物标本的物种有较高相似度的源（例如，兔、小鼠）的单克隆抗体效果更好。
浓度不能太高，否则会导致非特异性结合。
3、对于多蛋白共存的样本，应选择不同引物或标记抗体，以避免交叉反应。
三、标记物选择标记物的选择也影响到染色的结果。
多种标记物可应用于免疫组织化学染色，如酵素标记、荧光标记和金标记等，根据实验需要选择适当的标记物进行染色。
四、染色方法的优化免疫组织化学染色的过程需要进行优化，包括抗体浓度、背景消除步骤、染色时间和条件、固定剂和诱导剂浓度选取等等。
这些步骤都需要在实验室中进行研究和优化。
其中比较关键的是控制抗体浓度，以及对于背景的消除，可进行多次亲和吸附过程，获得更好的染色结果。
总之，免疫组织化学染色是一种重要的实验技术，它能够让我们观察到细胞和组织中蛋白质的分布和存在情况。
在实际应用中，我们需要注意样本的处理、抗体和标记物的选择以及染色方法的优化等关键步骤，以获得高质量的染色结果。
5.免疫组化染色中常见问题及处理
病理科常用肿瘤鉴别诊断标记物
免疫组化的临床应用
2、肿瘤的恶性程度与预后判断
近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列 腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、 PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基 因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤 相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断 和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。
2.染色阳性强度和阳性检出率相结合：
阳性细胞数＜25%
－
25%-50%
+
50%-75%
++
＞75%
+++
四、其他常见问题
（三）假阳性、假阴性及背景着色的原因 1、假阳性的原因 ➢抗体与非特异性抗原结合 ➢抗体浓度过高 ➢非特异性吸附 ➢内源性酶的催化作用 ➢人为判断失误 ➢外源性或内源性色素的干扰
（六）孵育方法及时间
环境：特制的湿盒内，避免切片干燥致染 色失败
温度及时间：37℃，1h
延长孵育时间：4℃过夜
（七）显色
两种方法：
（1）3,3’-二氨基联苯胺（DAB） 配制方法及注意事项：
现用现配，配好后30min内使用，作用时间 5min以内；配好后需过滤
DAB TBS（0.05mol/L，pH7.6 ） 30%H2O2（显色前加入）
－
－
抗体稀释度的测定
（2）棋盘法：当一抗、二抗、三抗都未知 稀释度时
二抗稀释度 1:50
一抗稀释度
1:100
1:200
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(－)
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤
免疫组化染色过程降低染色背景的步骤免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
在进行免疫组化染色时，染色背景的降低是非常重要的，可以提高染色的准确性和可视化效果。
以下是一些常用的步骤来降低免疫组化染色的背景：1. 组织固定：首先，将待染色的组织固定在载玻片上，常用的固定方法包括冷冻固定和乙醛固定。
固定可以防止组织中的蛋白质在染色过程中的流失和降解。
2. 抗体选择：选择合适的一抗和二抗是降低染色背景的关键。
一抗应该具有高度的特异性，可以选择经过验证的商业抗体或自制的抗体。
二抗应该来自于与待检测物种不同的物种，以避免非特异性结合。
3. 阻断非特异性结合位点：在染色前，使用一些阻断剂来阻断非特异性结合位点，例如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶原蛋白（Gelatin）、小鼠血清等。
阻断剂可以减少非特异性的背景染色。
4. 抗体稀释：对于一抗和二抗，应该根据实验需要进行适当的稀释。
稀释过高可能导致非特异性结合和背景染色的增加，稀释过低可能导致信号弱。
5. 温和的洗涤：在染色过程中，使用温和的洗涤缓冲液来洗涤载玻片，以去除非特异性结合的抗体和其他杂质。
洗涤缓冲液通常包含洗涤剂（如Tween-20）和盐类。
6. 使用负对照：在染色过程中，使用负对照来检测非特异性结合和背景染色。
负对照可以是未加一抗的组织切片或细胞，通过对比负对照和实验样品的染色结果，可以判断染色的特异性。
7. 图像分析：在染色完成后，使用合适的显微镜进行图像采集，并进行图像分析。
可以使用图像处理软件来减少背景噪音和增强信号。
总之，通过合适的固定、抗体选择、阻断非特异性结合位点、稀释、温和的洗涤、负对照和图像分析等步骤，可以有效地降低免疫组化染色的背景，提高染色结果的准确性和可视化效果。
免疫组织化学技术常见问题分析及对策
免疫组织化学技术常见问题分析及对策阳性对照标本和待测标本均无着色1. 可能原因分析1.1 抗体选择不当，不适合做IHC。
抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。
1.2 抗体工作浓度过低，特别是一抗的浓度过低。
同时也有可能是抗体孵育时间过短、温度偏低。
1.3 二抗与一抗种属不匹配，如一抗为鼠源性抗体，二抗没有使用抗鼠的抗体。
1.4 贴片法IHC染色有可能是抗体流失导致切片干燥。
1.5 石蜡切片未进行抗原修复或酶消化等前处理时间过长破坏了待检测抗原决定簇。
1.6 缓冲液PH值不当或含有酶活性抑制剂，如叠氮钠是过氧化物酶活性抑制剂。
1.7 DAB显色时间过短；显色底物不应该含有叠氮钠；在DAB显色时，显色液应该新鲜配制。
1.8 复染、脱水和封片剂的选择与显色系统不匹配。
1.9 阳性对照标本选择不合适，该标本不含有待检测抗原或与所用一抗试剂不匹配。
2. 处理方法2.1 确认使用抗体的各类抗体试剂的正确保存方法，保证其效价。
如果确认抗体已经失效，及时更换。
2.2 检查二抗是否与一抗种属匹配。
2.3 适当提高抗体浓度，优化孵育条件。
保证抗体孵育箱温度为37℃，或增加孵育时间，如4℃孵育48小时。
2.4 标本孵育盒平稳放置，防止孵育液流失。
2.5 参考文献选择标本类型适合的蛋白酶消化方法和抗原修复处理方式与条件。
2.6 调节缓冲液至对应正常的PH值，保证不含酶活性抑制剂。
2.7 重新配制DAB显色液，并保证配制方法、浓度、正确、有效，适当延长显色时间。
2.8 选择正确的阳性对照切片。
阴性对照标本未着色，而阳性对照标本和待测标本呈弱阳性1. 可能原因1.1 标本固定方式不正确，如固定不及时、固定液量太少、固定液失效或组织处理方式不当。
1.2 抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。
1.3 抗体浓度太低，特别是一抗的浓度过低，或者抗体孵育时间过短、温度偏低。
1.4 贴片法染色时标本上含有缓冲液，导致抗体浓度稀释。
免疫组化技术的关键问题汇总
免疫组化技术的关键问题汇总（1）2008-06-27 00:00 来源：互联网点击次数：4734 关键词：免疫组化技术关键问题汇总分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网一、组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1、组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24h。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2、组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
免疫组织化学常见问题
免疫组化常见问题及对策尊敬的各位代理，大家好！现在我就免疫组化常见问题及对策向大家做一简要介绍。
我公司所生产的抗体主要有两大用途，一个是免疫组化，另一个就是western blotting. 免疫组织化学是应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽、蛋白质等大分子物质的分布。
这种方法的特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
作为初次使用本公司的抗体从事免疫组化的客户可能遇到许多问题，大体归纳起来，主要有非特异性着色﹑着色部位不对﹑假阳性﹑无阳性﹑阳性弱五大类以及其他一些小问题。
现在就以上几点分别说明。
一、非特异性着色非特异性着色就是在理论着色区域外的着色，这种着色与背景是有区别性的。
造成非特异性着色的原因主要有：1)标本原因，肝肾内源性生物素含量高，与SABC结合导致非特异性着色，皮肤肺组织胶原含量高，由于胶原带负电荷，易吸附试剂导致非特异性着色。
2)切片干涸导致的边缘效应。
3)抗体浓度过高。
4)组织在处理中存在出血区域坏死区。
5)洗涤不充分。
6)显色剂氧化，显色时间长。
解决方法：1)一抗应做浓度梯度，选择阳性强背景好，信躁比高的浓度，做为抗体实验浓度，二抗浓度和时间一般不变。
2)稳定实验条件，严格按操作说明进行。
3)在实验中应保持切片始终处于水平状态避免抗体流失，从而使切片使切片干涸。
4)在实验中应将试剂覆盖面积大于切片面积5)洗涤要充分，在背景十分深时，可用37℃预温的PBS浸泡6)显色剂的配制要防止氧化，尤其是显色剂的配制是使用的容器，最好是灭菌过的。
显色时间应在显微镜下严格控制。
二、着色部位不对着色部位不对有三种情况。
情况一、本是胞浆抗原，但实验显示结果却在胞核有着色。
原因及解决办法：1)修复时间过长，修复条件十分严苛，这时应降低反应强度，减少修复时间。
2)组织在二甲苯中静置时间过长，这时应更换标本。
3)抗体中含有抗核蛋白抗体，这种情况已不多见。
4)标本原因，标本处理不慎会导致总在同一个地方出现着色。
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。
因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。
免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。
实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。
注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。
若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。
(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。
(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。
(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。
先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。
浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。
免疫组织化学染色质控及常见问题分析
第18卷第1期2009年2月中国组织化学与细胞化学杂志CHINESE JO URNAL O F HISTOC HEMISTRY A N D CYTOCHEMIST R YVol 1181No 11Fe b 12009免疫组织化学染色质控及常见问题分析栗 娜3 黄 虎(第161医院病理科,武汉 430010) 〔关键词〕 免疫组织化学; 质量控制〔中图分类号〕 R737133 〔文献标识码〕 A DOI :1013870/zgzzhx.2009.01.022〔收稿日期〕2525 〔修回日期〕22〔作者简介〕栗娜,女(年),汉族,病理科技师。
3通讯作者(T ) 免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理,对组织切片中抗原成分进行原位的定位、定性、定量研究的一种技术,在病理科工作中对疑难病例的诊断和分型有重要作用,并对指导临床治疗,了解肿瘤预后发挥重要作用,已成为病理科不可缺少的技术支持,因此免疫组化的质量控制显得尤为重要。
本室经过长期实践对其流程进行了严格规范,制定了严格的标准化流程,现介绍本室流程如下并对常见问题作逐一分析。
材料和方法11材料 常规送检病理标本,全自动脱水机,Leica 切片机,包埋机等。
21主要试剂 ER 、PR 、C K 、C EA 、CD20、CD30、CD15、K i67、S100、N F 2κB 、P27、P53等一抗及免疫组化染色S 2P 试剂盒、浓缩型DAB 试剂盒、抗体稀释液等,均购自上海长嘉生物技术有限公司。
31组织材料处理 1)固定:组织取材新鲜,固定及时,形态保存完整,抗原物质的抗原性不丢失、不扩散、不破坏是获得良好免疫组织化学结果的前提。
根据组织类型不同其固定时间一般应在6至48h ,固定时间不足,会造成抗原丢失,可产生组织表面抗原为阳性表达,中央为阴性表达,固定时间超过72h 会使抗原不可逆性破坏,无法修复,而产生阴性表达。
本室固定液采用低酒精浓度(75%的酒精)的混合固定液,p H 值3152410,固定时间为6至24h ,应注意当固定液p H 值大于810容易造成背景染色。
免疫化学染色技术常见问题及解决方法
免疫化学染色技术常见问题及解决方法染色不足
2. 阳性对照有足够的特异性染色，背景干净；组织显示很少或没有特异性染色，但在几种组织成分中有不同的程度的背景染色。
背景染色
1. 背景染色见于所有对照组织和标本组织，或在一些组织成分，如结缔组织、脂肪和上皮组
2. 标本组织和阴性试剂对照玻片显示背景染色，阳性和阴性对照组织显示正确的特异性染色；
局灶性背景染色
1. 在对照、标本和玻片的局部区域出现染色不一致
2.标本中的脂肪或结缔组织、阴性对照组织和阳性对照试剂玻片中，背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
3. 标本中的上皮组织、阴性对照组织、阳性对照组织和阴性对照试剂玻片中，特别在上皮呈中至强染色；背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
7. 应用生物素—链菌素卵白素染色系统时，在所有对照和标本组织中均见背景染色
不正确的“特异性”染色
1.在标本组织、阳性对照、阴性组织对照和阳性试剂对照的白细胞胞膜出现阳性染色。
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【 ４ 】 舒冬利 ．陆利萍． 手术 标本 的程序 化管 理［ Ｊ ］ ． 中华护理杂志 ，
２ ０ ０ ９ ， ４ ４ （ ６） ： ５ ４ ６ — ５ ４ ７ ．
２ ． ２ ． ６ 标本管理 ： 严格执行 标本 管理制度及核对制度 ， 实行标 本程序化管理 。主刀医生让家属看完标本后 ， 巡 回护士立 即 装 入写有患者完整信 息的标本袋 ， 并群 呼标本接 收人 员即时
液， 但禁 止在走廊输入 预防性抗生素 和麻醉术前药 。 并 告知患 者， 输 液期间身体若有 任何 不适 ， 立即告诉走廊里走过的任何
一
个人 ， 巡 回护士要 每隔几分钟查 看患者一 次。前一 台患 者
离开手术 间并 清理完卫生后 ， 连台患者再进 入手 术间输入抗
术室管理 的重点 ， 严格执行各项规章制度和技术操作规范 ， 提 高手术室护理人员隐患防范意识 ，养成 良好 的工作作风和习
会使组织扭 曲变得过分脆硬 ， 抗原减少或定位不准 ， 亦使免疫
（ 收稿 日期 ： ２ ０ １ ７ － ０ ２ － ０ ３ ）
免疫组织化学染色存在 的问题及解决方案
何新明 顾 霞 郭 文婷 林毅 妍 岳 永亮
２ ０世 纪 பைடு நூலகம் ０年代免疫组织化学 技术应用 于病 理诊断 ，目
前肿瘤 的病理诊 断应用最为广泛㈣。免疫组织化学染 色切 片
质 量 影 响 结 果 的判 断 ，由 于 免 疫 组 织 化 学 染 色 过 程 繁 杂 ， 步
有研 究表 明 ， 在延迟 ４ ８ ｈ 后 进行 固定 ， 免疫 组织化学 染色基
本看不到 明确 的膜 阳嗍 。尽 量缩短延迟 固定时间。 １ ． １ ． ２ 固定时 间的长短对组织抗 原的活性 的影 响：固定时间 不足易造成 固定液不能完全渗透至组织 内部 ，固定时间过长
骤多， 任何步骤均可能影响染色 ， 导致最终结果受到影响 。免 疫 组织化学染色结果可 以存 在各种各 样的 问题 ， 相应 的具 有 不 同的预防纠正措施 ， 现报告如下。 １ 假阴性或阳性 染色弱的原因及解 决方 案 １ ． １ 抗原 消失 或减 弱 主要是在制片过程中某一阶段 处理 不当而造成抗原 的破 坏， 如组织不够新鲜 、 固定 时间过长 、 抗原修 复不 当等。 １ ． １ ． １ 延 迟 固定 ： 在延迟 固定 时 ， 组织在 内外 源性蛋 白酶 的
实用医技杂志 ２ ０ １ ７ 年８ 月第 ２ ４卷第 ８ 期
Ｊ ｏ ｕ ｍＭ ｏ ｆ Ｐ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ＂ ｒ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｓ ， Ａ ｕ 鲫ｓ ｔ ２ ０ １ ７ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ４ ， Ｎ ｏ ． ８
・８ ７ １・
生素 ， 此期 间等待净化设备进行手术 间空气 的 自净 ， 输 完抗 生
素后再给术前药。 ２ ． ２ ． ４ 物品清点管理制度的完善 ： 严格执行双人双核对制度 ，
在手术开始前 、 关 闭体 腔前 、 关 闭体腔后 ， 皮肤缝 合后必须是
双人 四 目核对 器械物品 的数 目及完整性 ， 随后再 去准备下一
台的患者 。或 与手术医生协 商 ， 等前 台手术缝合 皮肤时再接
进 连台患者 ， 不为 了争抢几分钟导致忙乱 ， 而留下安全 隐患 。 ２ ． ２ ． ５ 术中输血管理 ： 术 中需要输血时 ， 巡 回护士先打 电话通
知血库患者信息及 用血类型 和用 血量 ， 取血人员 拿病 历到血 库 取血 ， 所有双核对都必须按照病历进行 ， 每次核对完都进行
消除其焦 虑与烦躁 。
收走 ， 在标本登记本上双签全名 。 ２ ． ２ ． ７ 手术物品准备 ：由器械室人员在前 １ 天下午根据次 日 手术排班表将第 ２天所有手术 的器械 、敷料包 摆放在各个手 术间 ，手术所 需特殊物 品由库房管理员在早晨 送至各个手术
间， 尽 量 减 少 巡 回护 士 的 忙乱 。
２ ． ２ ． ２ 安 全核查 ： 既便是连 台手术 ， 也要如 同第 一 台一样 ， 做
到患者被推进手术 间前 。 先进行病历与腕 带的核对 ， 并询问患 者科 室 、 手术 医生姓名 ， 查看手术 部位标识 。手术 医生 、 麻醉 医生 、 巡 回护 士三方在手术开 始前 、 麻 醉开始前 、 患者 离开手
定预见性 ， 会 提前 做好处理 ， 这样既能发挥老 同志 的才干也
能培养 和提高新护士 的工作能力 。 我院连台手术中曾经出现过 的问题 ，虽没有造成什么后 果， 但却给我们的工作提 出了瞢示 ， 督 促我们完善 了各项规章
制度 ， 优化了流程 ， 改进 了措施。连台手术 中的安全问题是手
惯， 根据工作流程按 部就班做好各项工 作 ， 防止忙 中出错 ， 才 能杜绝差错事故的发生 ， 确保手术患者的安全。
参 考 文 献
ｆ ｌ １ 汪苏英 ． 药剂科在 医院抗 菌药物正确应用 中的作用分析【 Ｊ ］ ． 中
国基层 医药 ，２ ０ １ ３ ， ２ ０ （ ５ ） ：７ ７ ７ ． ７ ７ ８ ． ｆ ２ １ 朱秀丽 ，周洁璐 ，赵学芳 ，等． 连台手术存 在的护理安全 问题 及 防范措施ｆ Ｊ １ ． 齐鲁护理杂志 ， ２ ０ ０ ６，１ ２ （ １ ２ Ｂ） ： ２ ５ １ ２ ． ２ ５ １ ３ ． 【 ３ １ 彭南海 ，杜益平．围手术期 护理 现念 、内涵和进展叨．实用 护 理杂志 ， ２ ０ ０ ２ ，１ ８ （ １ ） ：６ ．
术室前必须对患者身份及手术部位等信息进行再次确认和核
对。
２ ． ２ ． ８ 合理排班 ： 护士长在排班时 ， 根据护士能级及工作年 限
进行 老少搭配 。 年资高的护士经验 丰富， 对可能发生 的问题有
一
２ ． ２ ． ３ 输液管理 ：患者人手术室后如果前台手术需要 等待 时
间过 长 ， 为 了防止低血糖 的发 生 ， 我们 规定 可以先在 走廊 输