重组人碱性成纤维细胞生长因子工

吉林大学生命科学学院
硕士研究生论文
张淑子
中文摘要
人碱性成纤维细胞生长因子（human basic fibroblast growth factor, hbFGF）是成纤维细胞生长因子家族中的一员，能促进血管 内皮细胞、神经细胞、角膜细胞、软骨细胞等的生长，在临床上具 有很大的应用前景。本实验将含有重组质粒 pUC－hbFGF 的工程菌 经高密度发酵培养，进行 bFGF 融合蛋白的表达，其表达产率可达 160mg/L，菌体 OD600 值达 40.8；菌体经破碎、粗提后，进行离子 交换柱层析和亲和柱层析，得到 bFGF 融合蛋白纯品，蛋白回收率 为 2.6％，bFGF 回收率为 55％；生物学活性 ED50 为 0.45ng/ml，比 活性达 2.2×106U／mg，其纯度、分子量、残余 DNA 等各项检测 结果均符合“重组 DNA 制品质量控制要点”。活性 bFGF 的制备， 为其大规模生产和临床应用提供了依据。
作者姓名：张淑子 单位：生命科学学院 专 业：生物化学与分子生物学
导师姓名：张今 单位：生命科学学院 总页数：32 图象：无 开本：标准
中文主题标识：细胞生长因子 高密度发酵 纯化 英文主题标识：cell gro来自百度文库th factor
high density fermentation purification
bFGF 对于受照射的上皮细胞具有修复与保护作用[31－35] 。 bFGF 修复神经损伤，促进外周神经再生，防止体内损伤的胆碱能 神经元死亡。目前应用 bFGF 治疗神经系统疾病的研究包括：帕金 森综合症（已完成动物实验）、肌萎缩侧索硬化症、脑挫裂伤、脑 萎缩、周围神经损伤及神经性耳聋均取得了明显效果。
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硕士研究生论文
张淑子
前言
早在 30 年代末，Trowell 等发现机体组织提取物中有一种能促 进成纤维细胞生长的活性物质存在，但真正分离和鉴定出这一因子 却是近半个世纪以来的事。70 年代中期，Gospodarowicz 比较了机 体不同组织之间这种活性物质的含量，发现其在脑垂体中含量最 高，并首次将其从脑垂体中初步提纯出来，因其能促进成纤维细胞 增 殖 , 故 命 名 为 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 （fibroblast, growth factor, FGF）。后来发现 FGF 与肝素有特异性亲和力,据此特性引入肝素－ Sepharose 亲 和 层 析 使 得 FGF 纯 化 效 果 大 为 提 高 ， 采 用 Gospodarowica 介绍的硫酸铵盐析、CM-Sephadex C-50 阳离子交换 层析及肝素－Sepharose 亲和层析三步提纯方法可得到纯度达 90％ 以上的 FGF[1]。
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分类号：Q556 密 码：内部 学位门类：理科
硕士研究生论文
张淑子
单位代码：10183 研究生学号：09712015 论文提交日期：2000.5.30 论文答辩日期：2000.6..9.
硕士学位论文
中文题目：重组人碱性成纤维细胞生长因子工 程菌高密度发酵和纯化工艺的研究
英文题目：Study on high density fermentation and purification procedure for the E.coli having recombinant human basic fibroblast growth factor
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硕士研究生论文
张淑子
研究集中 FGF 等生长因子在急慢性脑缺血损伤的治疗，欧美国家 则重点研究促进急性心肌梗死部位侧支循环重建（生物搭桥），而 中国重视促缺血性肠、肝以及肾等内脏损伤修复方面的研究[28]。经 大量动物实验已证明在缺血再灌流早期一次性给予 bFGF，不仅能 显著改善伤后 1~2 天的肝肾功能，同时也能明显改善其形态学结构 [29]。此外，bFGF 可用于胃肠溃疡治疗，日本等正在将 FGF 等开发 成治疗胃肠道溃疡的新药[30]。
bFGF 广泛存在于脑、垂体、视网膜、骨、胎盘等动物的多种 组织中，由多种细胞产生，如垂体滤泡细胞、血管内皮细胞、神经 细胞等产生。bFGF 虽然在体内含量甚微，但其作用的靶细胞非常 广泛，生物学功能十分复杂。
bFGF 作为血管生长因子，在组织重建、胚胎发育和肿瘤发展 过程中广泛存在[12－17]，具有促进血管内皮细胞增殖作用，引起明显 的新血管生成效应，参与癌的发生发展过程，可用 bFGFmRNA 来 诊断恶性肿瘤[18－24]。
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硕士研究生论文
张淑子
提要
本实验将含有人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）的工程菌 进行了高密度发酵培养，摸索了工程菌高密度、高表达的工艺条件， 并通过柱层析系统进行了分离纯化得到 bFGF 融合蛋白纯品，经活 性、纯度、分子量等各项检测，结果均符合“重组 DNA 制品质量 控制要点”，为其大规模生产和临床应用提供了依据。
2、细胞 BALB／C 3T3 由中国生物制品检定所提供
3、标准品
蛋白含量标准品和 bFGF 活性标准品 由中国生物制品检定所
提供。
关键词：人碱性成纤维细胞生长因子 高密度发酵
融合蛋白
重组 DNA 制品
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Abstract
张淑子
Human basic fibroblast growth factor(hbFGF) is an importance one in cell. It can not only promote the growth of vascular endothelial, nervous cells, corneal epithelial and chondrocytes, but also possess great potential of clinical application. In this experiment, the E. coli having recombinant plasmid pUC-hbFGF were expressed fusion bFGF protein by high density fermentation. It’s expression level of bFGF and optical density(OD) were 160mg/L and 40.8 respectively. The expressed products were separated from cytoplasm by ultrasonication and purified by ion exchange and affinity chromatography. The results showed that protein recovery were 2.6% in total proteins of E.coli and 55% in bFGF proteins, respectively. From detecting result, the 50% effective dose(ED50) of final product were 0.45ng/ml, the specific activity reached 2.2×106u/mg. Other characterizations, such as the purity, molecular weight and residual DNA etc. also came up to Standard for the Control of Recombinant DNA products. The preparation of bio-active bFGF provide a foundation for both scale production and clinical application.
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张淑子
端的肽段部分缺失并不影响其促细胞增殖活力[4、5]。 近来研究已将编码人和牛 bFGF 的 cDNA 克隆并在大肠杆菌
中得以表达，确定了 bFGF 蛋白的全部氨基酸组成及其三维结构 [6] 。人和牛 bFGF 序列高度同源，仅相差 2 个氨基酸。1992 年 Zhux[6、 7]报道了 bFGF 三维晶体结构为含 3 组相似的β折叠模式，每组又 含有 4 个反平行的β折叠，无α螺旋，其活性部位为：“Asp－Gly －Arg”；在 bFGF 中含有 4 个半胱氨酸，但不含有二硫键[8－11]。
bFGF 与骨、软骨形成有关[36－40]，具有促进骨细胞分裂和形态 发生作用。
随着对 bFGF 生物学效应的深入研究，bFGF 为人们展示了日 益广阔的临床应用前景。bFGF 在治疗退行性神经系统疾病、脑缺 血疾病、冠心病、放射损伤、烧伤、创伤、眼科疾病、鼓膜穿孔、 溃疡、骨科疾病等过程中已得到肯定。因此，bFGF 有重要药用价 值。但由于天然 bFGF 在组织中含量甚微，从组织中提取则成本高， 产量低，国外报价 bFGF 的细胞提取物是 200 美元／微克，十分昂 贵；在工程系统中单一 bFGF 在大肠杆菌中的表达水平也极低，因 此，以融合蛋白形式才能进行高效、稳定表达，然后通过表达产物 的分离纯化可大量生产 bFGF，满足临床应用的需要。
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张淑子
材料
一、试剂
1、工程菌 由长春生物制品研究所提供。特点：宿主菌为
E.coli JM103；内含重组质粒 PUC－bFGF，启动子为 LacZ，启动
子后为人 bFGF 的 cDNA 序列；在 IPIG 诱导下，可表达成纤维细
胞生长因子（融合蛋白）；具有抗生素 Amp 抗性。
进一步研究表明，FGF 依其等电点可分为酸性 FGF(acidic FGF,aFGF)和碱性 FGF（basic FGF, bFGF）;aFGF 等电点为 5－7， bFGF 为 9.6。两类 FGF 经 cDNA 分析表明，都是由 154 个氨基酸 残基组成，分子量约为 18KD，两者结构和功能相似，其氨基酸顺 序同源性达 55％，作用于相同受体，均对热不稳定，易被蛋白酶降 解[2]。由于 bFGF N 端不稳定，且因提取方法等不同[3]，使得不同 组织中提取的 FGF 肽链长短多异，即不同 N 端截断形式，从 108 个氨基酸一 154 个氨基酸不等，但由于其活性部位在 C 端，故 N
Key words: hbFGF Fusion protein
High Density Fermentation Recombinant DNA Products.
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张淑子
目录
提要……………………………………………………………1 前言……………………………………………………………2 材料……………………………………………………………5 方法……………………………………………………………7 结果……………………………………………………………12 讨论……………………………………………………………21 结论……………………………………………………………25 致谢……………………………………………………………25 参考文献………………………………………………………26 中文摘要………………………………………………………29 英文摘要………………………………………………………30
bFGF 在创伤愈合与组织修复过程中起重要作用。bFGF 可“加 速”或促进体表软组织的创面修复过程，从而使整个愈合的速度与 质量发生明显变化[25]，如烧伤、供皮区、手术刀口等急性损伤创面 愈合较常规治疗提前 2~4 天[26]；对于慢性难愈合溃疡，由于创面内 源性生长因子含量缺乏或其受体活性呈下调状态，外用生长因子对 激活内源性生长因子活性或上调其受体表达均有明显作用，进而对 糖尿病溃疡、下肢静脉曲张性溃疡以及褥疮等都有明显的促修复作 用[27]；bFGF 还可促进缺血性内脏损伤的“主动修复”，目前，日本