硅胶柱层析分离荷叶化合物

硅胶柱分离纯化荷叶活性化合物

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程.大致步骤可分为装柱,上样，洗脱，收集处理。

荷是睡莲科植物中国莲的叶片，生长在水上，在我国南北均有分布。荷叶甘、平、无毒，具有消暑、清肺、安心神等作用。现代研究表明，荷叶营养丰富，除含有普通植物所共有的碳水化合物、脂类，蛋白质、单宁等常规化学成分外，还富含具有明显生物活性和生理功能的黄酮类化合物和生物碱这两大类物质。黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物, 在植物体内大部分与糖结合成苷类, 有一部分是以游离态( 苷元) 形式存在的。绝大多数的植物体内都含有黄酮类化合物, 它们对植物的生长、发育、开花、结果及防菌防病等起着重要的作用。黄酮类化合物是许多中草药的有效成分, 具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、抗炎和免疫调节活性、抗病毒活性、解毒护肝和细胞保护作用、对心血管疾病的作用、对机体内分泌和代谢的影响、对细胞的影响和抗菌作用等多种生物活性, 近年来国内外学者对其颇为重视。而近10 年来, 对黄酮类化合物的研究倾向于对其药用价值的开发, 更多地涉及提取分离纯

化方法的应用研究、含量测定及制剂研究等。

硅胶柱层析的一般步骤为：

1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。

4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg 上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。

7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1-2个数量级。

8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

一：实验原料与试剂：

1原料：新鲜荷叶。

2试剂：甲醇，乙醇，石油醚（均为分析纯）

主要仪器：电热恒温干燥箱，真空冷冻干燥机，电子分析天平，硅胶，层析缸，层析柱。

二：实验方法：

1荷叶粗提物制备：将新鲜荷叶洗净沥干，放于干燥箱低温(50℃)烘干，取出粉碎得荷叶粉；取荷叶粉10g放入500ml带塞三角瓶中加人70%的乙醇300mL，在80℃水浴中浸提2h，浸提两次，合并滤液，得荷叶乙醇粗提液。

去除叶绿素、叶蜡：用石油醚(浓度和体积与乙醇同)对粗提液进行萃取。将石油醚萃取部分蒸干，回收石油醚；将乙醇部分蒸干，回收乙醇，得荷叶浸膏。

去除蛋白质、糖类：将荷叶浸膏用95%乙醇溶解，再将滤液进行真空冷冻干燥，得荷叶提取物。

2硅胶柱层析分离纯化：

以100~200目的硅胶进行湿法装柱（柱长100cm,内径3.5cm）；取少许荷叶提取物，用无水甲醇溶解（约15ml），上硅胶柱，用甲醇洗脱，采用定时收集方式收集。