酶的提取
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解酶提取的基本原理和方法。
2. 掌握酶提取过程中的操作技巧。
3. 学习酶活性检测的方法。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性和活性。
酶提取实验的目的是从生物材料中提取酶，并对其进行纯化和活性检测。
酶提取的基本原理是利用生物材料中的酶具有特异性的结合位点，通过合适的溶剂、温度、pH等条件，使酶从生物材料中释放出来。
三、实验材料1. 生物材料：新鲜菠菜、酵母粉、淀粉酶等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS、DTT、EDTA、蛋白酶抑制剂等。
3. 仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、水浴锅、电子天平等。
四、实验步骤1. 酶提取（1）取适量新鲜菠菜，用剪刀剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀。
（2）将混合物放入高速冷冻离心机，以4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）加入适量SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂，混匀。
（4）将混合物置于低温冰箱中保存。
2. 酶活性检测（1）取适量酶提取液，加入适量底物，混匀。
（2）将混合物置于水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
（3）终止反应，加入适量显色剂，混匀。
（4）在特定波长下测定吸光度值，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 酶提取结果通过离心分离，成功提取了菠菜中的酶。
酶提取液在低温冰箱中保存，待后续实验使用。
2. 酶活性检测结果通过酶活性检测，得到了酶提取液的活性值。
根据实验数据，计算出酶的活性单位。
六、实验讨论1. 酶提取过程中，选择合适的溶剂、温度、pH等条件对酶的提取效果至关重要。
在本实验中，我们选择了Tris-HCl缓冲液作为溶剂，pH 7.0为酶提取的最佳pH 值。
2. 酶提取过程中，添加SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂等试剂，可以保护酶的活性，防止酶在提取过程中被破坏。
3. 酶活性检测是评价酶提取效果的重要指标。
在本实验中，我们通过测定酶活性单位，对酶提取效果进行了评价。
酶的提取及纯化
1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
酶的提取方法
酶的提取方法
酶的提取方法有多种，以下是一些常用的方法：
1. 机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。
研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。
2. 化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。
例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～
3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。
3. 酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。
但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。
4. 冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。
5. 过滤：可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。
6. 搅拌：加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。
7. 提取溶剂：可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。
请注意，这些方法可能对不同的酶类效果不同，因此在实际操作中应根据实际情况选择合适的方法。
酶的主要提取方法及其优缺点
酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。
3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。
2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。
而温度系数最小（对温度不敏感）。
3）价格便宜。
浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。
缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。
由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
酶的提取与分离纯化课件
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
19
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
20
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
7
二、细胞破碎（胞内酶）
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第二节酶的提取
第二节 酶的提取
3.提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率。但是过量的提取 液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利。故提取液 的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可 分几次提取，若辅以缓侵搅拌，则可提高提取率。 4.添加保护剂 在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性 失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某 些抗氧化剂等保护剂。
第二节 酶的提取
4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多 的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用 有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、 丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取 效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、 胆碱酯酶等的提取。
第二节 酶的提取
一、酶提取的主要方法
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不 同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸 溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
第二节 酶的提取
1.盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下， 酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太 高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用 稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～ 0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的 α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯 化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇 脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸 葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生 的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
酶的提取技术
四、酶的提取技术1、酶提取的方法（1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。
但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。
一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。
以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。
在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。
如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。
同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。
分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。
盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。
盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。
用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。
（2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清楚。
各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。
乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。
有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。
分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。
按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。
由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
主要影响因素
扩散的影响：
酶分子的扩散速度与温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离以及两相 界面的浓度差有密切关系。提高温度、降低溶液黏度、增加扩散面积、缩 短扩散距离, 增大浓度差等都有利于提高酶分子扩散速度, 从而增大提取效 果。 含酶原料的颗粒体积越小,则扩散面积越大,有利于提高扩散速度;适当的搅 拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面,从而增大两相界面的浓 度差,有利于提高扩散速率;适当延长提取时间,可以使更多的酶溶解出来,直 至达到平衡。
2. 酸溶液提取
3. 碱溶液提取 4. 有机溶剂提取
表4-2 酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶
酸溶液提取
碱溶液提取
pH值为2～6的水溶液
pH值为8～12的水溶液
指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
饱和度＝
溶液中饱和硫酸铵的体积
溶液的总体积
3) 调整盐浓度的方式
a.
饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又 不太高时。
配制饱和硫酸铵溶液
在水中加入过量的固体硫酸铵, 加热至50～60℃, 保 温数分钟 , 趁热滤去过量未溶解的硫酸铵 , 滤液在0℃ 或 25℃平衡1～2 天, 有固体析出, 此溶液即为饱和硫酸铵溶 液, 其饱和度为1。
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同, 通过添加 一定量的某种有机溶剂, 使酶或杂质沉淀析出, 从而使酶 与杂质分离 在酶液中加入某些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀下来, 从而使酶与杂质分离
酶的分离与提纯
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操
作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一
步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能 知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少， 从而决定着每一步骤的取舍。
酶活力也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应 的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活 力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶 促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。一般以产物增量来表示酶促反 应速度。 防止酶在分离纯化过程中丧失活性.
• ①比色法 如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而
生成稳定的有色溶液，且生成颜色的深浅与产物的浓度 在一定的范围内有线性关系可用此法。 • ②量气法：主要用于有气体产生的酶促反应。如氨基酸 脱羧酶、脲酶的活力测定。产生的二氧化碳量可用特制
的仪器如瓦氏呼吸仪测定之。根据气体变化和时间的关
系，即可求得酶反应的速度。来自 标。需注意：
• 在酶的分离纯化过程中进行酶活力及酶比活力 表测定的原因是：一方面，防止酶变性失活。
一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯化方法；
另一方面，计算纯化效率。通过总活力和比活， 评估纯化效率，寻找最佳方法。
为防止酶在分离纯化过程中丧失活性。进行酶活回收率和酶
比活力提高比的测定。 1.酶活性回收率:反应提纯过程中酶活力的损失情况 总活力水收率=纯化后总活力/纯化前总活力*100% 由于酶是具有生物活性的催化物质，对反应的条件要求高， 所以反应后会由于环境的变化失活。 2.酶比活力提高比：指的是反应前后的酶比活力的比值。
酶比活力
• 酶比活力是在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
酶的提取和分离纯化
酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
酶分离纯化的工艺流程设计
合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时 又提高产品纯度和质量为前提。
对一个方法好坏的评价标准是： 1.酶的回收率 2.酶产品的比活力
此法效率较低
机械破碎法
3.匀浆法
利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破 碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也 可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来 破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小 的组织细胞。
此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较 少，但难于在工业生产上应用。
11.2.2 物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的 作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物 理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎
所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法 可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方 法有 （1）蒸发法 （2）反复冻融法 （3）胶过滤 （4）超滤法
2.初步提纯
除去大分子的核酸和粘多糖 （1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或
MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。 （2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性
材料选择及其前处理
动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织 植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种
子用乙醚等脱脂 微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离 胞外酶
酶 胞内酶 结酶 溶酶
11.2 细胞破碎
除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之 外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分 离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有:
剂等处理解决，有时也用酶。
经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白， 分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作， 就是将酶从杂蛋白中分离出来。
第三章 酶的提取与分离纯化
第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
第五章 酶的提取与分离纯化
仅适用于细胞壁较脆弱的细胞，或者细胞壁预先用酶 处理，或者在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
对革兰氏阳性菌不适用,为什么？ 由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽多糖组成，可以
承受渗透压的变化，而不致细胞破碎。
3、超声波破碎法
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复 多次。
冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
细胞干燥法：如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷 冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞 的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞 进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。
2、酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好， 宜用酸溶液提取。
如：从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可用 0.12mol/L的H2SO4。
提取时要注意溶液的pH值不能太低，以免使酶变 性失活。
3、碱溶液提取
有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好， 宜用碱溶液提取。 注意事项:
操作时要注意pH值不能过高，以免影响酶的活性。 加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现
局部过碱现象，引起酶的变性失活。
4、有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多 的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比 例的有机溶剂提取。
常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等，这些溶剂 可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂 性。
二、物理破碎法
各种物理因素：
温度、压力、声波等的作用，使组织细胞破碎
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，热胀冷缩的作用使细胞破碎。 对那些较脆弱、易破的细胞破碎效果好，但在酶的
酶提取的主要方法和注意事项
酶提取的主要方法和注意事项
酶提取的主要方法：
1. 食物酶提取：将食物酶从植物或动物中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。
2. 微生物酶提取：将微生物酶从土壤中提取出来，常用的方法有振荡培养、深桶培养、喷雾培养等。
3. 动物酶提取：将动物酶从动物组织中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。
酶提取的注意事项：
1. 样品准备：在提取酶之前，应准备好样品，并将它们放在干燥处储存。
2. 酶稳定性：应确保酶的稳定性，以避免提取过程中的损失。
3. 防止污染：在提取酶的过程中，应防止其它酶的污染。
4. 避免高温：在提取酶的过程中，应避免高温，以避免酶的失活。
5. 储存酶：提取出来的酶应放在干燥处储存，并尽量避免接触空气，以避免酶的失活。
6. 确定活性：在提取酶之前，应先确定酶的活性，以便选择合适的提取方法。
简述酶提取的过程及其原理
简述酶提取的过程及其原理酶提取是一种将酶分离、纯化和富集的方法。
它是一项关键的生物技术，广泛应用于医学、食品工业、生物工程和农业生产等领域。
酶提取的过程涉及样品的处理、细胞破碎、分离纯化和稳定等步骤，并且其原理基于酶在化学环境中的特性和提取技术。
酶提取的过程主要包括以下几个步骤：1. 样品的处理：在进行酶提取之前，需要对样品进行必要的处理。
这可能包括去除杂质、脂肪、蛋白质以及其他可能影响酶纯化的成分。
此外，在酶提取之前，还需要对样品进行预处理，如搅拌、离心、过滤等，以达到更好的分离和纯化效果。
2. 细胞破碎：将细胞破碎是酶提取的关键步骤之一。
细胞破碎的目的是释放酶并将其分离出来。
常见的破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解破碎等。
物理破碎主要依靠高压机械力、超声波或高压抗冻聚能技术等。
化学破碎可以使用酸、碱或酶等化学物质来破坏细胞膜结构。
酶解破碎则利用酶的特性来破坏细胞膜。
3. 分离纯化：分离纯化是酶提取的重要步骤之一，目的是从复杂的混合物中高效地分离目标酶。
常见的分离技术有沉淀、过滤、离心、柱层析等。
其中，柱层析是一种常用且有效的方法，根据酶的特性和物理化学性质，通过选择性吸附和洗脱的方法实现酶的纯化。
柱层析常用的分离材料有凝胶过滤、离子交换、亲和层析和凝胶过滤等。
4. 稳定性评估：提取酶之后，需要对酶的稳定性进行评估。
酶在提取过程中常常会受到温度、pH、离子浓度和蛋白质浓度等环境因素的影响，从而导致酶的活性损失或失活。
稳定性评估试验可以通过测定酶的活性来评估其在不同条件下的稳定性，并找出最适宜的储存和使用条件。
酶提取过程的原理主要基于酶分子的特性和物理化学性质，如分子量、电荷、亲和性等。
不同的酶在提取过程中会因其特性的不同而选择不同的提取方法。
下面是几个常见的酶提取原理：1. 溶液条件：酶在某一特定条件下，如适宜的pH、离子浓度、温度等，具有较高的活性和稳定性。
通过调整溶液条件，可以提高酶的活性和稳定性，从而更好地提取酶。
名词解释酶的提取
名词解释酶的提取酶是一种生物催化剂，它能够加速化学反应的速度，在生物体内起着关键的作用。
它们是由特定的蛋白质分子所组成，具有高度的专一性，能够与底物结合形成酶底物复合物，并通过催化底物分子之间的化学反应使其转化成产物。
酶具有非常广泛的应用，包括食品工业、制药工业、生物技术等领域。
酶的提取是一项关键的工艺，它涉及到从生物体中获得纯净、活性高的酶。
酶的提取工艺通常分为几个步骤，包括细胞破碎、分离和提纯等过程。
细胞破碎是酶提取的第一步，它的目的是将生物体中的酶释放出来。
常用的破碎方法包括机械破碎、超声波破碎和化学破碎等。
机械破碎是将生物体经过高速搅拌或研磨来破碎细胞壁，使酶释放到溶液中。
超声波破碎则是利用超声波的高频振动产生的剪切力将细胞破碎。
化学破碎是通过添加化学物质来破坏细胞壁，使酶释放出来。
分离是酶提取的第二步，它的目的是将酶从其他组分中分离出来。
常用的分离方法包括离心、过滤和沉淀等。
离心是通过高速旋转来使细胞碎片、细胞核和其他细胞组分分离。
过滤则是利用过滤器的孔径将大分子物质或颗粒物质滤除，从而得到酶溶液。
沉淀是通过改变溶液的性质使酶在溶液中沉淀，然后通过离心将酶沉淀出来。
提纯是酶提取的最后一步，它的目的是获得纯净的酶。
常用的提纯方法包括层析、电泳和凝胶过滤等。
层析是将酶溶液通过填充有吸附剂的柱子，根据酶与吸附剂之间的亲和性差异使酶与杂质分离。
电泳则是利用电场作用下酶的电荷和大小差异使酶与其他组分分离。
凝胶过滤是利用凝胶孔径的大小将酶和其他组分分离。
除了上述工艺步骤外，酶的提取还需要注意一些关键因素，包括温度、pH值和浓度等。
不同的酶对这些因素的要求不同，因此在提取过程中需要根据具体情况进行优化。
此外，酶在提取过程中还需要考虑保存和稳定性等问题，以确保酶的活性和纯度。
总的来说，酶的提取是一项复杂而关键的工艺，它涉及到多个步骤和因素的综合考虑。
通过合理的工艺设计和条件控制，可以获得高纯度、高活性的酶，从而满足不同领域的需求。
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碱溶液提取
在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。操作时pH不能过高，以免影响 酶的活性。同时加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现局部过碱，引起酶的变性失活。
有机溶液提取
与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶，可以采用能与水混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶 剂提取。例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等采用丁醇提取，都取得良好效果。
谢谢大家
2016年12月11日
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
提取方法
盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取
使用的溶剂或溶液
0.02～0.5mol/L的盐溶液 PH2～6的水溶液 PH8～12的水溶液 可与水混溶的有机溶剂
提取对象
用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶
提取原则
提取方法
影响因素
b、保持生物活性
a、目的酶最大限度地 溶解出来
注意：温度升高，溶解度增加，但为防止酶 失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。
PART.02
提取原则
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
相似相溶
远离等电点的pH值， 溶解度增加
PART.03
提取方法
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
提取液的体积对酶的提取影响
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对
进一步的分离纯化不利。所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。
内部沸腾法
内部沸腾是一种真正的内部沸腾，它 通过外部大量的热溶剂加热先渗透到物 料内部的少量解吸溶剂，并使之沸腾汽 化，产生内部对流，强化有效成分的扩 散，提取效率明显提高。
盐溶液提取
大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加， 这称为盐溶现象。当盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐的浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。
酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。提取时要注意溶液的pH不能 太低，以免使酶变性失活。例如，胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取等
酶的提取与分离纯化
环境与生物工程学院
专业：生物工程
弘德博问、和谐创新
教案：周聃一
讲解：锁进猛
教案：杨睿祎
引入课题
提取：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将
尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。
目录页
1 2 3 4
提取目标
提取原则
提取方法
影响因素
PART.01
提取目标
提前目标
PART.04
影响因素
提前目标
提取原则
提取方法
影响因素
温度对酶的提取影响
提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶 解度，也可以增大酶分子的扩散速度。
pH对酶的提取影响
溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。为了提高酶的溶解度，提取时 pH值应 该避开酶的等电点。