高效液相色谱( high performance liquid chromatography, HPLC

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高效液相色谱法测定血清葡萄糖

陈忠余;张天娇;张传宝;张江涛;周伟燕;闫颖;陈文祥

【摘要】目的建立一种测定血清葡萄糖(glucose,Glu)的高效液相色谱法(HPLC),探讨其能否作为血清Glu测定的参考方法.方法以D-半乳糖(D-galactose)为内标物,用无水乙醇沉淀、去除血清中的蛋白质,在pH9.1条件下与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)反应,用HPLC测定血清Glu衍生产物、D-半乳糖衍生产物,用标准曲线法定量；对建立的方法进行方法学评价.结果本法测定血清Glu的批内变异系数(CV)为0.33％～ 0.67％,平均0.51％；批间CV为0.02％～ 0.85％,平均0.38％；总CV为0.47％～ 1.03％,平均0.68％.回收率为98.22％～ 101.96％.分析Glu 的参考物质SRM 965a,测定结果与认定值的偏差为-0.928％～0.347％,平均偏差为- 0.072％.结论初步建立了测定血清Glu的HPLC法；该法准确、精密,有望作为血清Glu测定的候选参考方法.

【期刊名称】《临床检验杂志》

【年(卷),期】2011(029)009

【总页数】3页(P660-662)

【关键词】葡萄糖;高效液相色谱;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

【作者】陈忠余;张天娇;张传宝;张江涛;周伟燕;闫颖;陈文祥

【作者单位】重庆市第一人民医院检验科,重庆400011;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京100730;卫生部北京医院卫生部临床检验中

HPLC高效液相色谱法培训解析

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色谱分离系统
• 保护柱 • 色谱柱 • 柱温箱 • 柱切换阀
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色谱柱
• 色谱柱是分离好坏的关键
• 使用时，流动相的方向应与柱的填充方向一致。色谱柱的柱管外壁都以箭头显著地标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时要使流动相按箭头所指方向流动。
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色谱柱(尺寸)
分析型：Ø 4.6mm 制备型：Ø＞5mm以上微径柱：Ø <2.1mm 柱长：10～25cm，30cm 少见柱体：直型优质不锈钢柱管
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梯度洗脱系统（高压梯度）
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进样系统
• 作用：将试样引入色谱柱 • 位置：在高压泵和色谱柱之间 • 类型：手动或自动 • 进样器：六通阀
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进样器
手动六通阀经注射器进样自动六通阀
圆盘式自动进样器
链式自动进样器
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六通阀手动进样器原理示意图
Load
Inject
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六通阀
A 正相色谱
• （1）基本概念 • （2）正相色谱分离原理 • （3）正相色谱的固定相
• （4）正相色谱的流动相
• （5）正相色谱的应用
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（1）基本概念
• 正相色谱——固定相为极性基团，流动相为非极性溶剂。固定相极性大于流动相的一种色谱方法。 • 由于固定相极性大于流动相，这种相对关系正好与液-固色谱法相同，因而这种色谱方法被称为正相色谱法。被共价结合在载体上的固定相，是常见的一级氨基和氰基。

柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成

马定远　陈　君　李　萍3

胡卓逸

(中国药科大学生药药用植物教研室,南京210038)

(中国药科大学生化研究室,南京210009)

摘　要　报道了多糖中单糖组成的柱前衍生化高效液相色谱测定方法。采用反向高效液相色谱250nm 紫外检测和使用梯度洗脱,6种还原单糖的12苯基232甲基252吡唑啉酮衍生实现了良好的分离并具有良好的峰形。对单糖组成的定量测定进行了方法学考察,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。关键词　单糖,多糖,衍生化,高效液相色谱

　2001207204收稿;2002201209接受

1　引言

单糖的组成分析是糖分析中的一项重要内容。已有的糖组成分析方法以气相色谱法和高效液相色谱法为主。由于单糖分子的多样性,关于糖的分析方法仍在不断发展。12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP )衍生化方法自运用以来,得到不断完善1～3。Strydom 运用此法对中性、酸性和碱性醛糖进行了分析,可以使15种单糖得到很好的分离2。本文首先建立了6种常见单糖(包括一种酸性糖)的分离模式,通过内标法对3种中性单糖的定量进行了方法学考察,并应用所建立的方法对多糖中的单糖进行了组成分析,为此法的更好运用提供了依据。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

HP1100型高效液相色谱系统,包括G 1312A 二元泵,G 1315A DAD 检测器,HP ChemStation 色谱工作站(Hewlett 2Packard )。

高效液相色谱仪HighPerformanceLiquidChromatographppt课件

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·储液器 ·输液泵 ·进样器 ·色谱柱 ·检测器 ·操作软件
三.仪器组成
5
1.储液器盛放流动相，材质一般为玻璃，也有不锈钢或特种塑料材质，容积大小不等，以500-2000ml比较常见。
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2.输液泵
2.1 基本要求：提供5-50Mpa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10ml/min；流量精密度RSD 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀，耐高压，没有爆炸危险。
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5.7 质谱检测器(MSD) ：是另一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。
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Baidu Nhomakorabea
应用范围和主要特点
紫外-可见
二极管阵列
荧光示差折光蒸发光电化学(电导)
有紫外吸收的物质，大多数有机物都可以检测优点：噪声低，对流动相的温度变化不敏感，检测后不破坏样品，可用于制备。缺点：紫外吸收大的溶剂不能用做流动相
5.6 电化学检测器(ED) ：电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。

高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC) High Performance Liquid

Chromatography

§3-1 高效液相色谱法概述

一、定义

以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。

高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.

二、HPLC特点

1、高压

经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;

2、高速

由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。

3、高效

HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。

4、高灵敏度

利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。

紫外检测器10-9g

荧光检测器10-11g

高效液相色谱

三、液相色谱分离原理及分类

液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。

根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、

化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。

四、液相色谱与气相色谱的比较

1、相同点

（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。

（2）基本概念一致：

基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。

（3）基本理论一致：

塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。

高效液相色谱法名词解释

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种分离技术，利用液相为移动相，在液体流动状态下，将各种化合物从混合物中分离出来的一种分析方法。HPLC常用于药物分析，环境监测，食品检测等领域，具有分离效率高、分析速度快、样品损失小、灵敏度高、选择性强、重现性好等优点。HPLC的基本部件包括流动相系统、进样系统、柱温控制系统、检测器和数据处理系统。常用的检测器有UV-Vis吸收光谱、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器等。

仪器分析第三章高效液相色谱分析

分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化四丁基铵
分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷磺酸钠；
反相离子对色谱：固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱) 流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
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4、离子交换色谱
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。
稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇
线性梯度淋洗，2%/min 流速：1mL/min 柱温：50 ºC 柱压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
选择性； • 对多环芳烃，维生素、
氨基酸、蛋白质等有响应；
•
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c. 示差折光检测器（通用型检测器）
（ differential refractive index detector）可连续检测参比池和样品池中溶液之间的折光指数差值
，差值与浓度呈正比。
通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；
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§3-4 液相色谱固定相
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。

高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)

GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
正相的出峰顺序：极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分；反相出峰顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱；适于分离非极性组分。
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团
通过化学反应键合到硅胶（担体）表面
的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
的重要可选择参数。
2、涡流扩散项及其影响
A = 2λ • dp A ∝ λ • dp
，dp A H ，n 柱效
降低固定相粒度粒径小的、分布均匀
的球形固定相可提高柱效。
3、传质阻力项及其影响
C = Cm + Csm + Cs
≈C m
+
C
（忽
sm
略固
定相
传质
阻力）
⇒HPLC：H = A + Cm • u + Csm • u

高效液相色谱(HPLCHigh Performance Liquid

高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。

高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。

一、基本原理

固定相流动相

B C

固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。

HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。

通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数

亲和色谱：——亲和力

吸附色谱：——吸附力

离子交换色谱：——离子交换能力

凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻

分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。

反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。

固定相（柱填料）：

固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。

高效液相色谱法测定小麦粉中过氧化苯甲酰

２．２进样量的选择
测试１．０μＬ～１０．０μＬ不同进样量对色谱峰形的影响，实验表明进样量为１μＬ时色谱峰太小，色谱峰自动积分不准确，不利于定量测定。进样量过大容易引起拖尾现象，进样量为５．０μＬ时峰形较好，故实验选择进样量为５．０μＬ。２．３柱温的选择
· ４２ ·
粮食储藏
２０１３（３）
测要求。
２．５方法回收率和精密度
本方法的回收率以未检测出过氧化苯甲酰的小
麦粉为基底，添加苯甲酸标准溶液，添加水平为
１．６ｍｇ／ｋｇ、１０．９ｍｇ／ｋｇ、２０．８ｍｇ／ｋｇ，每一水平平行测定２次。苯甲酸回收率为９１．０％～１１０．０％，表明方法准确度良好，能够满足分析需要。
２结果与讨论
２．１标准曲线范围及线性关系由于卫生部等六部委发布通告，自２０１１年５
图３苯甲酸标准溶液校准曲线由图３可知，苯甲酸标准溶液浓度范围在０～２０μｇ／ｍＬ时，浓度与峰面积线性关系良好，Ｙ＝３１．８８Ｘ＋５．４４，ｒ＝９９．９２，保留时间为３．７ｍｉｎ。
檱檱殗

高效液相色谱原理-第一讲

高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生 “伪峰”。化学稳定性好低粘度(粘度适中) 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离 ①常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等； ②但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀, 小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC). 因分析速度快而又称为高速液相色谱法 (High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
原理与结构
高效液相色谱
(High performance Liquid Chromatography，HPLC)
第一部分
一、色谱概述二、高效液相色谱(HPLC)
三、几种主要的HPLC
四、HPLC特点、流程及主要部件
一、色谱概述
1.什么是色谱?

反相高效液相色谱

实验结果：
实验注意事项：
1、蛋白质是具有边缘疏水性的偶极离子，因此色谱柱必须是带有芳族或者脂族的硅胶 2、RP-HPLC要用有机溶剂来分离分子，此类溶剂会破坏蛋白质的三维结构，因此此种方法只适合用来分离制备化学分析用的蛋白质或者蛋白片段 3、分离钙调蛋白肽段的色谱柱要选择C8柱 4、要在低波长（210nm）下监测 5、样品需用TFA 稀释
• 分配色谱法
反相色谱法(reversedphasechromatography)流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。
正相色谱法(normalphasechromatography)固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。

微柱高效液相色谱法测定杨梅黄酮类物质

胡秋芬1,2杨亚玲2黄章杰2杨光宇2尹家元2

(1玉溪师范学院化学系玉溪 653100 2云南大学化学系昆明 650091)

摘要经固相萃取预分离，由微柱高效液相色谱法测定了几种杨梅树叶和树皮中的黄酮类物质。杨梅中主要的黄酮成分在 2.0min内可达到基线分离；用紫外二极管矩阵检测器检测。方法标准

回收率为97％～103%，相对标准偏差为1.6%～2.2%。

关键词高效液相色谱固相萃取杨梅黄酮

The Determination of Myrica Rubra Flavonoid by Microcolumn High

Performance Liquid Chromatography

Hu Qiufen 1,2, Yang Yaling 1, Huang Zhangjie 2, Yang Guangyu 2, Yin Jiayuan 2

(1 Department of Chemistry, Yuxi Teacher’s College, Yuxi 653100; 2 Department of Chemistry, Yunnan University, Kunming 650091)

Abstract A microcolumn high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of flavonoid in myrica rubra leaf and bark was studied. The flavonoid was separated on a

《仪器分析》4-高效液相色谱法

精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
再用泵输出色谱柱；高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统梯
度混合室，加以混合后送入色谱柱。
精选课件
在分离过程中，使流动相的组成、极性、pH等按一定程序连续变化，使样品中各组分能在最佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。
通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。
精选课件
(4) 示差折光检测器：是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器；缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
⑴ 适用范围

高效液相色谱测定季铵盐复合消毒液中的苯扎溴铵和邻苯二甲醛

PTCA(PA RT B: CH EM. A N A L.)

工作简报

D O I： 10.11973/lhjy-hx202011011

高效液相色谱测定季铵盐复合消毒液中的

苯扎溴铵和邻苯二甲醛

睢超霞，王舒雨，王克

(河南医学高等专科学校药学系化学教研室，郑州451191)

摘要：建立了高效液相色谱法（HPLC)同时测定季铵盐复合消毒液样品中苯扎溴铵和邻苯二甲醛（O PA)含量的方法。用流动相[体积比为1 :1的0.02 mol .I. ―1的乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH 4.5)和甲醇混合而成]将1.0 m L样品定容至10.0 mL•滿旋混合5 m in后过0.45 p m滤膜，取滤液供H P L C分析。以XDB-C18色谱柱为固定相，用流动相进行等度洗脱分离，在检测波长263 n m处测定目标物。结果表明，苯扎溴铵和（)P A标准曲线的线性范围均为10.0〜800.0 mg .

L一1 ,方法检出限（3S/N)分别为5.0,3.5 mg •L、以此方法分析了3个样品，所得结果和标示值一致，测定值的相对标准偏差（》=7)均小于1.0%。以这3个样品为基质进行3个浓度水平的加标回收试验，得到苯扎溴铵和（)P A的回收率分别为93.7%〜95.2%和94.5%〜98.5%。

关键词：高效液相色谱法；苯扎溴铵；邻苯二甲醛；季铵盐复合消毒液

中图分类号：0657.7 文献标志码：A文章编号：1001-4020(2020)11-1201-04

邻苯二甲醛（OPA)是双醛基芳香化合物，具有腐蚀性小和毒性低等优点，是医院消化内镜首选消毒剂:1]。文献[2]研究了 4种市售（)P A消毒剂的细菌芽孢杀灭效果.其中3种O P A消毒剂在作用300 m in的杀灭对数仍不理想。文献[3]将苯扎溴铵作为增效成分，与（)P A复配后制备了季铵盐复合消毒液，改变了单一O P A作用时杀灭细菌芽孢速度慢的缺点。文献[4]认为复合消毒液中的苯扎溴铵能够附着在菌体表面，改变细胞壁和细胞膜的通透性和渗透压.使O P A更易进人细胞内部，从而增强了细菌芽孢杀灭效果。苯扎溴铵和O P A的配比会影响这种复合消毒液的杀菌效果，因此，需要建立一种可以同时测定这两种物质含量的方法，以控制生产过程中两者的含量和配比。但是，由于复合消毒液的基质较为复杂，目前还未见可供参考的国家标准和文献方法。

高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用

孙会敏,田颂九

(中国食品药品检定研究院,北京100050)

摘要:高效液相色谱法(high perfor m ance li qu i d chrom atography,简称HPLC)是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法,已在药品检验中获得广泛应用,发挥巨大作用。本文介绍了高效液相色谱法的有关知识、新方法和技术以及在药品检验中的应用。

关键词:高效液相色谱法;药品检验;综述

中图分类号:R96511文献标识码:A文章编号:1672-7738(2011)01-0038-05

HPLC m et hod i n troduction and its application in drug cont rol

SU N H ui-m in,TI AN Song-jiu

(N ational Institutes for F ood and D rug C ontrol,B eijing100050,China)

AB STRACT:HPLC(h i gh perfor m ance liquid chrom atog raphy)i s a chroma tog raphy m e t hod based on t he c l assi c liqu i d chrom atography.R elated pr i nc i ples,new m ethods or techno l ogy and app licati ons i n drug contro l o fHPLC w ere i ntroduced i n th i s a rti c l e.