色谱分析
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（三） 定量方法
1.间接定量法
间接定量法就是将 TLC 已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该 洗脱液进行定量分析。TLC 间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样 的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对 下一步定量方法应无影响。
a. 分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和 标准液进行吸光值测量。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果 直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二 薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开
（一）薄层板
TLC 分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。可 通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱 分离的选择性。此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也 对其色谱行为产生影响。
TLC 固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、 不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
（三）点样
点样是TLC分离和精确定量的关键。不同种类的样品常需选用不同的配样溶 剂，一般采用易挥发的非极性或弱极性溶剂配样。离子型化合物样品，常需先衍 生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。最适合点样的样品浓 度应为（1～5）μg·μL-1，点样体积视点样技术不同而异。TLC定量分析时， 样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。样品原点一般在 1mm左右为 佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。点样步骤一般占TLC全部分析时 间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获得好的重复性， 是TLC工作者所期盼的。
（4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点 （无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使 这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺
涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应 用最广泛的涂板方法。
(1)溶剂纯度，含有杂质影响分离。 (2)溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。 (3)存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。
(4)混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组 成随时改变。
（二）几种常用薄层色谱分离模式的展开机制
1.液固吸附展开
在 TLC 分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开常用极性吸附 硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶 剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：
b. 目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法 显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列的斑点 相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品的重 复分析。
七 应用实例—TLC测定黄曲霉毒素B1
（一）、原理
根据黄曲霉毒素 B1 能在波长 365 毫微米紫外光下产生蓝紫色荧光的特性， 采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光 的最低检出量来测定其含量。
如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：称取粉碎过筛样品 20 克 于 250 毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴加 6 毫升水，使样品湿润，并准确加入氯
仿 60 毫升，振荡 30 分，加无水硫酸钠 12 克，振摇静止 30 分；以脱脂棉过滤取 滤液 12 毫升（相当于样品 4 克）于蒸发皿，以下步骤与①同。
2.板上化学反应定性
板上化学反应定性主要有以下两种方式： a. 反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物； b. 反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹” 特征加以鉴定； c. 除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC 与其他联用技术间
接联用定性、薄层色谱－傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱－质谱联用 定性。
色谱分析
第一章薄层色谱法（TLC）
一 薄层色谱法概述
薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或 保留而将其分离的方法。与 HPLC 不同，TLC 将固定相涂铺在栽板上，使之形 成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入 盛有流动相（深度约 5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。 被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和 定量的检测结果。
［注］加入氯仿振摇 2 分钟如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层或用电吹 风机吹热风促使分层。
含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取粉碎样品 20 克移于 滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器内，在 75－85℃水 浴上以石油醚提取脱油 8 小时，然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于 250 毫升具塞三角烧瓶内，进行检验。
（二）定性方法
1.利用保留值定性
在特定的色谱系统中，化合物的 Rf 值一定，比较未知物和标准物的 Rf 值， 能够作为鉴定未知物的依据。Rf 值的准确测定受多方面因素影响，为了增加 Rf 值定性的可靠性，必须通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的 Rf 值。如果在分离机理不同的色谱体系中，比较 Rf 值仍能得到肯定的结果，那么 其可靠性将更大。
四 薄层色谱吸附剂与载体的选择
1.薄层色谱对吸附剂的要求为：
1.具有大的表面积与足够的吸附能力； 2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分； 3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解； 4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用 5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂 6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸； 7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。
2.分配色谱对所用载体的要求为：
a.表面积大； b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用； c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；
d.对固体液是惰性的。
五 薄层色谱扫描仪
（一）仪器结构
TLC 扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件 组合系统。
（二）主要功能
②适用于花生油、香油、芽籽油等。 称取样品 4 克于小烧杯中，用正已烷 20 毫升转移于 125 毫升分液漏斗中， 再用甲醇水（55+45）20 毫升分数次洗涤小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振 摇 2 分钟，静止分层后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗 中再加甲醇水 5 毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入第二个分液漏斗中， 在第二个分液漏斗中加入氯仿 20 毫升，振摇二分静止分层以后按①操作。 ③适用于酱油、醋，方法有二： 第一法：称取样品 10 克于小烧杯中，为防止提取时乳化，加氯化钠 4 克， 移于分液漏斗中，烧杯用氯仿 15 毫升分次洗涤，洗液一并移于分液漏斗中，以 下自振摇 2 分钟，静止分层后按第①操作。最后加入 2.5 毫升苯乙腈溶解，此液 每毫升相当于样品 4 克。 第二法：称取样品 10 克移于分液漏斗中，加甲醇 12 毫升（以酱油代替水， 故甲醇与水体积比仍约为 55+45）加氯仿 20 毫升提取，以下自振摇 2 分钟起， 按①操作，最后加苯乙腈 2.5 毫升，每毫升相当于样品 4 克。 ④适用于酱类（包括豆乳制品） 称取样品 20 克于 250 毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷 20 毫升与甲醇水 50 毫升，振荡 30 分钟，静止片刻，以脱脂棉过滤，滤液静止分层后，取甲醇水 24 毫升于分液漏斗中加入氯仿 20 毫升振荡 2 分静止分层下以按①操作，最后加入 苯乙腈 2 毫升，每毫升相当于样品 4 克。 注：以上检品极易乳化，实在分不开层时，可采用离心分层的办法。 ⑤适用于发酵酒类 称取样品 10 克于小烧杯中，以氯仿 15 毫升分次洗于分液漏斗中，振摇 2 分钟，静置分层后按①操作，最后加入苯乙腈 2.5 毫升，此溶液每毫升相当于样 品 4 克。 ⑥适用发酵用曲种及菌株 称取样品 10 克于具塞三角烧瓶中，加入正已烷 30 毫升与甲醇水（55+45） 80 毫升，振荡半小时，用脱脂棉过滤于分液漏斗中，取出甲醇水溶液 32 毫升（相 当于样品 4 克）于另一分液漏斗中，加入 30 毫升氯仿提取。振摇 2 分静止分层。
（1）载体 对 TLC 载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、 显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相 TLC 固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。硅胶和氧化 铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂 在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的 是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。常用的粘合 剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
薄层色谱扫描仪主要用于 TLC 图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测 量。要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200～800nm）检测器灵 敏度高。
六 薄层色谱定性定量方法
（一）斑点定位
斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短 波长紫外灯，使用方便、灵活。采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向 展开好的薄层板喷洒显色试剂。
（二）、试剂
1.石油醚：沸程 30－60℃ 2.正已烷
3.氯仿 4.苯 5.乙腈 6.甲醇 7.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。 8.丙酮 9.无水硫酸钠 10.硅胶 G：薄层层析用 11.苯乙腈混合液：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混匀冰箱存放备用。 12.三氟醋酸 13.黄曲霉毒素消毒剂：5％次氯酸钠溶液，取 100 克漂粉精，加入 500 毫升 水，搅匀，另溶解 70 克碳酸钠（Na2Co3、H2O）于 500 毫升温水中，溶后，倒入 上述溶液中搅匀、澄清、过滤、备用。 14.黄曲霉毒素标准溶液 ①标准储备液（1.02 微克/毫升）：GBW(E)090015 严格控制、应加锁于冰箱 中避光存放。（每次记录用量、余量，以备复查）。 ②稀释液Ⅰ（0.2 微克/毫升）取储备液加苯乙腈混合液稀释。 ③稀释液Ⅱ（0.04 微克/毫升）取稀释液 1 毫升以苯乙腈混合液稀释。
a. 溶剂对样品的溶解能力； b. 溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争； c. 溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。
2.液液分配展开
与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不 同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。
除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。
（三）、仪器
1.小型粉碎机 2.分样筛一套 3.电动振荡器 4.电吹风机 5.薄层板涂布器（可以自制） 6.玻璃板：5×20 厘米 7.展开槽：（层析）内长 25 厘米，宽 6 厘米，高 4 厘米 8.1－10 毫升刻度吸管 9.紫外光灯：365nm，220v，125w，启动电流 1.8A 10.微量进样器：20 微升，10 微升
（四）展开
TLC 展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的 过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，直线 式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。
三 薄层色谱流动相与展开机制
（一）对流动相溶剂选择的基本考虑
薄层色谱溶剂的选择对分离的影响很大。与 HPLC 同理，对复杂样品的分离 能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分 子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组 分的分离。对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以 下因素的影响：
11.分液漏斗：125 毫升 12.蒸发器：60 毫升 13.玻璃漏斗 14.样液瓶：具塞 2 毫升 15.脱脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小时挥干备用 16.电热恒温水浴
（四源自文库、操作方法
1.提取
①适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。称取经 过粉碎（20 目筛）的样品 20 克于 250 毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷 30 毫升， 甲醇水（55∶45）100 毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡 30 分钟，静置 片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲醇水溶液 20 毫升（相 当于样品 4 克）于另一分漏斗中，加氯仿 20 毫升，振摇二分钟，静止分层。另 备一漏斗底部铺脱脂棉少许，再加无水硫酸钠 10 克，下接 60 毫升蒸发皿，漏斗 中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的 漏斗中，过滤，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中， 最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入以上蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱内于 65℃水浴上通风挥干，然后放在水浴上冷却 2－3 分钟，准确加入苯乙腈 1 毫升。 用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合，若有结晶析出（苯），将蒸发皿从水 浴上取下，继续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于 2 毫升样 液瓶中，若溶液不够澄清，应离心，或放置等候澄清，取上清液供薄层点板用。
b. HPLC 法 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 HPLC 分离和定量 c. GC 法 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 GC 分离和定量。 d. 质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。
2.直接定量法
a. 斑点面积测量法 以半透明纸扫下 TLC 图上的斑点界限，然后测量其面 积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。
1.间接定量法
间接定量法就是将 TLC 已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该 洗脱液进行定量分析。TLC 间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样 的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对 下一步定量方法应无影响。
a. 分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和 标准液进行吸光值测量。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果 直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二 薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开
（一）薄层板
TLC 分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。可 通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱 分离的选择性。此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也 对其色谱行为产生影响。
TLC 固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、 不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
（三）点样
点样是TLC分离和精确定量的关键。不同种类的样品常需选用不同的配样溶 剂，一般采用易挥发的非极性或弱极性溶剂配样。离子型化合物样品，常需先衍 生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。最适合点样的样品浓 度应为（1～5）μg·μL-1，点样体积视点样技术不同而异。TLC定量分析时， 样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。样品原点一般在 1mm左右为 佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。点样步骤一般占TLC全部分析时 间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获得好的重复性， 是TLC工作者所期盼的。
（4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点 （无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使 这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺
涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应 用最广泛的涂板方法。
(1)溶剂纯度，含有杂质影响分离。 (2)溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。 (3)存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。
(4)混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组 成随时改变。
（二）几种常用薄层色谱分离模式的展开机制
1.液固吸附展开
在 TLC 分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开常用极性吸附 硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶 剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：
b. 目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法 显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列的斑点 相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品的重 复分析。
七 应用实例—TLC测定黄曲霉毒素B1
（一）、原理
根据黄曲霉毒素 B1 能在波长 365 毫微米紫外光下产生蓝紫色荧光的特性， 采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光 的最低检出量来测定其含量。
如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：称取粉碎过筛样品 20 克 于 250 毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴加 6 毫升水，使样品湿润，并准确加入氯
仿 60 毫升，振荡 30 分，加无水硫酸钠 12 克，振摇静止 30 分；以脱脂棉过滤取 滤液 12 毫升（相当于样品 4 克）于蒸发皿，以下步骤与①同。
2.板上化学反应定性
板上化学反应定性主要有以下两种方式： a. 反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物； b. 反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹” 特征加以鉴定； c. 除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC 与其他联用技术间
接联用定性、薄层色谱－傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱－质谱联用 定性。
色谱分析
第一章薄层色谱法（TLC）
一 薄层色谱法概述
薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或 保留而将其分离的方法。与 HPLC 不同，TLC 将固定相涂铺在栽板上，使之形 成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入 盛有流动相（深度约 5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。 被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和 定量的检测结果。
［注］加入氯仿振摇 2 分钟如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层或用电吹 风机吹热风促使分层。
含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取粉碎样品 20 克移于 滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器内，在 75－85℃水 浴上以石油醚提取脱油 8 小时，然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于 250 毫升具塞三角烧瓶内，进行检验。
（二）定性方法
1.利用保留值定性
在特定的色谱系统中，化合物的 Rf 值一定，比较未知物和标准物的 Rf 值， 能够作为鉴定未知物的依据。Rf 值的准确测定受多方面因素影响，为了增加 Rf 值定性的可靠性，必须通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的 Rf 值。如果在分离机理不同的色谱体系中，比较 Rf 值仍能得到肯定的结果，那么 其可靠性将更大。
四 薄层色谱吸附剂与载体的选择
1.薄层色谱对吸附剂的要求为：
1.具有大的表面积与足够的吸附能力； 2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分； 3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解； 4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用 5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂 6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸； 7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。
2.分配色谱对所用载体的要求为：
a.表面积大； b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用； c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；
d.对固体液是惰性的。
五 薄层色谱扫描仪
（一）仪器结构
TLC 扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件 组合系统。
（二）主要功能
②适用于花生油、香油、芽籽油等。 称取样品 4 克于小烧杯中，用正已烷 20 毫升转移于 125 毫升分液漏斗中， 再用甲醇水（55+45）20 毫升分数次洗涤小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振 摇 2 分钟，静止分层后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗 中再加甲醇水 5 毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入第二个分液漏斗中， 在第二个分液漏斗中加入氯仿 20 毫升，振摇二分静止分层以后按①操作。 ③适用于酱油、醋，方法有二： 第一法：称取样品 10 克于小烧杯中，为防止提取时乳化，加氯化钠 4 克， 移于分液漏斗中，烧杯用氯仿 15 毫升分次洗涤，洗液一并移于分液漏斗中，以 下自振摇 2 分钟，静止分层后按第①操作。最后加入 2.5 毫升苯乙腈溶解，此液 每毫升相当于样品 4 克。 第二法：称取样品 10 克移于分液漏斗中，加甲醇 12 毫升（以酱油代替水， 故甲醇与水体积比仍约为 55+45）加氯仿 20 毫升提取，以下自振摇 2 分钟起， 按①操作，最后加苯乙腈 2.5 毫升，每毫升相当于样品 4 克。 ④适用于酱类（包括豆乳制品） 称取样品 20 克于 250 毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷 20 毫升与甲醇水 50 毫升，振荡 30 分钟，静止片刻，以脱脂棉过滤，滤液静止分层后，取甲醇水 24 毫升于分液漏斗中加入氯仿 20 毫升振荡 2 分静止分层下以按①操作，最后加入 苯乙腈 2 毫升，每毫升相当于样品 4 克。 注：以上检品极易乳化，实在分不开层时，可采用离心分层的办法。 ⑤适用于发酵酒类 称取样品 10 克于小烧杯中，以氯仿 15 毫升分次洗于分液漏斗中，振摇 2 分钟，静置分层后按①操作，最后加入苯乙腈 2.5 毫升，此溶液每毫升相当于样 品 4 克。 ⑥适用发酵用曲种及菌株 称取样品 10 克于具塞三角烧瓶中，加入正已烷 30 毫升与甲醇水（55+45） 80 毫升，振荡半小时，用脱脂棉过滤于分液漏斗中，取出甲醇水溶液 32 毫升（相 当于样品 4 克）于另一分液漏斗中，加入 30 毫升氯仿提取。振摇 2 分静止分层。
（1）载体 对 TLC 载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、 显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相 TLC 固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。硅胶和氧化 铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂 在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的 是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。常用的粘合 剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
薄层色谱扫描仪主要用于 TLC 图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测 量。要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200～800nm）检测器灵 敏度高。
六 薄层色谱定性定量方法
（一）斑点定位
斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短 波长紫外灯，使用方便、灵活。采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向 展开好的薄层板喷洒显色试剂。
（二）、试剂
1.石油醚：沸程 30－60℃ 2.正已烷
3.氯仿 4.苯 5.乙腈 6.甲醇 7.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。 8.丙酮 9.无水硫酸钠 10.硅胶 G：薄层层析用 11.苯乙腈混合液：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混匀冰箱存放备用。 12.三氟醋酸 13.黄曲霉毒素消毒剂：5％次氯酸钠溶液，取 100 克漂粉精，加入 500 毫升 水，搅匀，另溶解 70 克碳酸钠（Na2Co3、H2O）于 500 毫升温水中，溶后，倒入 上述溶液中搅匀、澄清、过滤、备用。 14.黄曲霉毒素标准溶液 ①标准储备液（1.02 微克/毫升）：GBW(E)090015 严格控制、应加锁于冰箱 中避光存放。（每次记录用量、余量，以备复查）。 ②稀释液Ⅰ（0.2 微克/毫升）取储备液加苯乙腈混合液稀释。 ③稀释液Ⅱ（0.04 微克/毫升）取稀释液 1 毫升以苯乙腈混合液稀释。
a. 溶剂对样品的溶解能力； b. 溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争； c. 溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。
2.液液分配展开
与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不 同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。
除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。
（三）、仪器
1.小型粉碎机 2.分样筛一套 3.电动振荡器 4.电吹风机 5.薄层板涂布器（可以自制） 6.玻璃板：5×20 厘米 7.展开槽：（层析）内长 25 厘米，宽 6 厘米，高 4 厘米 8.1－10 毫升刻度吸管 9.紫外光灯：365nm，220v，125w，启动电流 1.8A 10.微量进样器：20 微升，10 微升
（四）展开
TLC 展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的 过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，直线 式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。
三 薄层色谱流动相与展开机制
（一）对流动相溶剂选择的基本考虑
薄层色谱溶剂的选择对分离的影响很大。与 HPLC 同理，对复杂样品的分离 能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分 子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组 分的分离。对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以 下因素的影响：
11.分液漏斗：125 毫升 12.蒸发器：60 毫升 13.玻璃漏斗 14.样液瓶：具塞 2 毫升 15.脱脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小时挥干备用 16.电热恒温水浴
（四源自文库、操作方法
1.提取
①适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。称取经 过粉碎（20 目筛）的样品 20 克于 250 毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷 30 毫升， 甲醇水（55∶45）100 毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡 30 分钟，静置 片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲醇水溶液 20 毫升（相 当于样品 4 克）于另一分漏斗中，加氯仿 20 毫升，振摇二分钟，静止分层。另 备一漏斗底部铺脱脂棉少许，再加无水硫酸钠 10 克，下接 60 毫升蒸发皿，漏斗 中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的 漏斗中，过滤，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中， 最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入以上蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱内于 65℃水浴上通风挥干，然后放在水浴上冷却 2－3 分钟，准确加入苯乙腈 1 毫升。 用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合，若有结晶析出（苯），将蒸发皿从水 浴上取下，继续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于 2 毫升样 液瓶中，若溶液不够澄清，应离心，或放置等候澄清，取上清液供薄层点板用。
b. HPLC 法 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 HPLC 分离和定量 c. GC 法 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 GC 分离和定量。 d. 质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。
2.直接定量法
a. 斑点面积测量法 以半透明纸扫下 TLC 图上的斑点界限，然后测量其面 积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。