Agela液相色谱技术介绍&色谱柱使用

供试品：理论板数（ 17400 ）、对称性（ 0.80 ）
流动相：乙腈-0.2％冰醋酸溶液（80:20）； 流 速： 0.5 ml/min 测：蒸发光散射检测器（ELSD）；
250
22.697
200
检
150
进样量：20µl； 柱 温：20℃
0 5 10 15 20 25 min
100
葡萄糖分析
2000.00 1800.00 1600.00 1400.00 1200.00
氨基柱：氨丙基键合硅胶
LS 单位
1000.00 800.00 600.00 400.00 200.00 0.00 -200.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 分钟 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00
2000.00 1800.00 1600.00 1400.00 1200.00
α k' N 如何控制分辨率?
影响色谱柱性能的因素
色谱柱与色谱填料的特性
1、 柱填料 • 硅胶纯度 • 粒径（及粒径分布） • 比表面积 • 孔径 2、 色谱柱的构型 • 色谱柱直径 • 色谱柱长度 3、 固定相 • 键合类型 • 残余硅羟基的影响 • 反相键合相的保留行为 • 键合硅胶的稳定性
300
10.963
300
200
200
1.774
7.237
8 2 .7 1
100
100
0
0
0
2
4
Байду номын сангаас
6
8
10
12
14
m in
1 0 .9 7
5 1 .7 3 1
4 6 8 10 12 14 m in
400
2.550 2.834
400
0
2
MP C18(2) pH5.8
3 4 .5 2 4 8 .8 2
Atlantis T3 pH5.8
Venusil MP C18（2），硅羟基pH=5.2
流动相pH=3.5，能充分抑制硅羟基的活性
抑制了二次保留效应
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100%水流动相的兼容性
样品：尿苷 色谱柱：4.6*150mm,5μm 流动相：100%水 流速：1mL/min 温度：30℃
目标物A、B
-R -OH -O- H+
反相作用 氢键作用 弱离子交换作用
反相作用 氢键作用 弱离子交换作用
甲醇 /乙腈 水 缓冲盐溶液
固定相
流动相
pH对分离的重要影响
10 9 8 7 6
O R C O H
调节ph值对样品的 分离非常有效
弱碱
k’
5 4 3 2 1 0 2 4 6
弱酸
O R C O
8
Agela液相色谱介绍
Agela HPLC技术支持：郑晶
色谱分离基本方程
HPLC柱的 “色品”表达 式
n R 4
1 k 1 k
提高分离度R，需要分别增大n，α，k值
n：柱效，易受柱长、填料粒径的影响 α：选择性，易受流动相和固定相影响； k：保留因子，受固定相和流动相的影响
与被分析物极性基团相互作用：增加极性化合物的保留
与硅胶表面残余硅羟基相互作用：改善拖尾，改善极性化合物的峰
型，提高分离效率；
Venusil HILIC色谱柱：
益母草中盐酸水苏碱的测定（中国药典2010版修订品种）
ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (Y MCFFX\2DZ21.D) mAU 300
强酸下使用的ASB C18色谱柱
R = 异丙基， 防止键合相流失
优势 适用于pH 0.8-4的流动相 使得对pH较敏感的分离得到优化 极低pH有较好的柱效和使用寿命
酸性条件下的良好寿命
样 品：萘酚； 色谱柱：Venusil® ASB C18，5μm，4.6×150mm； 流动相：(TFA) 三氟乙酸 in 80% 甲醇 (pH=1.5)，1mL/min； 进样量：5μL； 温 度：30℃； 波 长：UV254nm
2.870
800 700 600 500
800 700 600 500
400 300 200
2.424 2.754
400 300 200
1.697
1.487
2.159 2.511
2.617
100 0 0 1
7.734
100 0
2
3
4
5
6
7
8
m in
9.282
2 3 4 5 6 7 8 9 m in
0
V W D 1A ,波 长 =254nm(水 溶 维 生 素 2\选 择 性 测 试 30度 低 P H \O D S -A Q _000001.D ) m A U m A U
V W D 1A ,波 长 = 254nm(水 溶 维 生 素 2\选 择 性 测 试 30度 低 P H \菲 罗 门 _000003.D )
碱性化合物阿米替林在不同pH下保留时间的变化
V W D 1A ,波 长 = 2 5 4n m (水 溶 维 生 素 2 \选 择 性 测 试 3 0 度 低 P H \2 7 0 8 _ 0 0 0 0 0 1 .D ) m A U 8 0 0
m A U 800 V W D 1A ,波 长 =254nm(水 溶 维 生 素 2\选 择 性 测 试 30度 低 P H \亚 特 兰 蒂 斯 _000002.D )
•柱效（n）对分离度（R）的影响
“高富帅”
以上两张谱图k, α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它 们具有不同的分离度。
•分离选择性（α）对分离度（R）的影响
' tR '2 t R1
α =1.04
α =1.35
α =1.50
改变分离选择性α的方法
• • • 改变固定相 改变流动相pH值 改用不同的流动相
中等PH值范围，碱性化合物没有三乙胺添加剂也可提供更好的峰型
样 品：1. 尿嘧啶（碱性） ，2. 对乙酰氨基酚 （弱酸性） ，3. 苯乙酮(中性)，4. 水杨酸（酸性） ； 流动相：1% 乙酸 (pH=2.57) : 甲醇 =50:50； 流 速：1mL/min； 柱 温：30℃； 波 长：UV275nm；
LS 单位
8.122
1000.00 800.00 600.00 400.00 200.00 0.00 -200.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00
pH = pK
pH
色谱柱固定相稳定性
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Agela 色谱柱最佳pH适用范围
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中等pH下使用 C18
Venusil MP C18 (2), 孔径110Å 特点：亲水性、通用性、 良好分离能力
1
YMC ODS-AQ pH2.6
V W D 1A ,波 长 = 2 5 4n m(X B P -C 1 8 -2 \选 择 性 3 0摄 氏 度 \O D S -A Q _ 0 0 0 0 0 1 .D ) m A U
Hydro RP pH2.6
V W D 1A ,波 长 = 2 5 4n m(X B P -C 1 8 -2 \选 择 性 30摄 氏 度 \菲 罗 门 _000002.D ) m A U
色谱柱：5μm，4.6×250mm； 样 品：芦荟大黄素、大黄酸、大黄 素、大黄酚、大黄甲醚； 流动相：甲醇 :0.1% 磷酸 =80:20； 波 长：254 nm； 柱 温：室温； 流 速：1.0 mL/min
高pH值流动相优势
流动相pH对RPC保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系
色谱柱：4.6*250mm，5μm，C18，流动相：0.025M磷酸盐、40%甲醇； 样品：1 水杨酸；2 苯巴比妥；3 非那西丁；4 尼古丁；5 甲基丙苯丙胺
对照品：理论板数（22757）、对称性（0.94）
22.752
+ N O
O . HCL
250
200
盐酸水苏碱
色谱柱：
0 5 10 15 20 25 min
150
100
50
Venusil HILIC柱(丙基酰胺键合硅胶)， 100Å，4.6×250mm，5µm
ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (Y MCFFX\JMD1.D) Norm. 300
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核心技术- 表面杂化技术
宽泛的pH使用范围 (2.0-12.0) 低硅羟基活性 高pH下拥有良好的寿命 对碱性化合物有很大的载样量，适用于制备
Durashell 液相色谱柱：
Durashell C18，C18(L)，C8
高pH条件首选
老化条件
初始：0h
流 动 相：甲醇: pH=12 三乙胺溶液 = 40:60 流 柱 速：1.0 ml/min; 温：40 ℃;
色谱柱：4.6×150；5µm；200 Å
测试条件
流 动 相：甲醇:水=85:15 流 速：0.8 ml/min
250 h后
检测波长：254 nm;
柱 温：30 ℃;
进 样 量：1µ L 色谱柱：4.6×150；5µm；200 Å 样 品：尿嘧啶、苯酚、硝基苯、萘
4 0 0
2.474 2.832
400
3 0 0
300
16.459
2.5672.191
5 0 0
500
2 0 0
200
1.729
7.922
1.505
1 0 0
100
0
0
9.468
21.946
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
1 8
m in
0
5
10
15
20
25
m in
YMC ODS-AQ pH5.8
Hydro RP pH5.8
9 5 .5 3
7 0 0 6 0 0
700 600
9 4 .5 2 7 6 .8 2
5 0 0 4 0 0 3 0 0
500
400 300
4 6 .7 1
8 5 .5 7
1.704
2 0 0 1 0 0 0 0 1
200 100 0
2.502 2.821
3.470
2
3
4
5
6
7
8
m in
7.732
2 3 4 5 6 7 8 m in
0
1
MP C18(2) pH2.6
V W D 1A ,波 长 = 254nm(X B P -C 18-2\选 择 性 30摄 氏 度 \2607_000001.D ) m A U m AU 500 500
Atlantis T3 pH2.6
V W D 1A ,波 长 =254nm(X B P -C 18-2\选 择 性 30摄 氏 度 \W A TE R S -亚 特 兰 蒂 斯 _02.D )
酸性条件分离酸性物质
样 品：Vc，丙二酸，乳酸，柠檬酸； 流动相：20mM 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH=2.0； 流 速：1mL/min； 进样量：5μL； 波 长：UV210nm；
亲水作用液相色谱柱 Venusil HILIC
分离机理
反相液相色谱（RPLC）是最广的色谱分离技术，可解决多种分析应 用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很 少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环 保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。但是在这种 实验条件下，很多极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了 NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水 作用液相色谱-HILIC。
•
改变柱温
•容量因子（k）对分离度（R）的影响
n R 4
1 k 1 k
' tR k tM
容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大 延长。因此，k的最佳范围是1<k<20。
改变容量因子的方法有： •减小柱死体积 •改变柱温 •改变流动相的配比 •梯度洗脱
样 品：1. 尿嘧啶，2. 甲苯，3. 多塞平（碱性） ， 4. 阿米替林（碱性） ； 流动相：10mM 磷酸钠( pH =7):乙睛=40:60； 流 速：1mL/min； 柱 温：30℃； 波 长：UV254nm；
耐污染，高寿命，高耐受性的XBP C18 (L)
孔径：150Å
杂质不易进入空隙而强保留 表面积减小，减小极性小物质的保留时间
7
物理因素
化学因素
硅胶制作工艺
Aggregation
Polymerization
堆砌法硅胶 Innoval、UHP、Bonshell 优点：高机械强度，耐污染 共聚法硅胶 Venusil、Durashell 优点：分离效果佳
硅胶基质反相色谱分离三要素
疏水部分（链烃和芳香烃） 羟基、氨基 离子化基团
双层表面处理技术
减低硅胶表面硅羟基的活性
中等pH下良好的分离能力
色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm， 样品：吗啡、可待因，脱氢吗啡的分离，流动相:乙腈-25 mM乙酸钠缓冲液（ pH 3.5）= 10：90，
色谱柱A，硅羟基pH=3.5
流动相pH=3.5，未能抑制硅羟基的活性 二次保留严重