分子生物学常用技术(简化版)
常用的分子生物学基本技术简介
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR 法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。
测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。
目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。
化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。
一般能读出200-250个核苷酸序列。
双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。
基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。
至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。
目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。
分子生物学内容方法
分子生物学内容方法
分子生物学是一个广泛的领域，涉及到生物大分子的结构、功能和相互作用。
在这个领域中，有许多不同的方法和技术，用于研究和分析分子生物学方面的问题。
以下是一些常见的分子生物学方法：
1. 基因克隆：这个方法可以用于将目标DNA片段插入到表达载体中，从而生产大量目标蛋白质。
这个过程涉及到PCR、DNA纯化、限制性酶切和连接等步骤。
2. 蛋白质纯化：这个方法通常用于从细胞中提取和纯化目标蛋白质。
这个过程涉及到细胞破碎、离心、柱层析和电泳等步骤。
3. DNA测序：这个方法用于确定DNA分子的序列。
这个过程涉及到DNA扩增、纯化、测序和分析等步骤。
4. PCR：这个方法用于扩增目标DNA片段。
这个过程涉及到DNA模板、引物、酶和缓冲液等组分。
5. RNA干扰：这个方法用于沉默特定基因的表达。
这个过程涉及到合成siRNA和转染细胞等步骤。
6. 蛋白质互作：这个方法用于研究蛋白质之间的相互作用。
这个过程涉及到酵母双杂交、GST pull-down和共免疫沉淀等步骤。
总的来说，分子生物学方法是一个不断发展和改进的领域，可以用于解决许多生物学问题。
不同的方法和技术可以根据具体问题的需要进行选择和组合。
- 1 -。
分子生物学的方法和技术
分子生物学的方法和技术随着科技的不断进步，人们对于分子生物学的研究也越来越深入。
分子生物学是研究生物分子结构、功能及其相互作用的一门学科。
它在疾病诊断、基因工程、药物研究开发等领域都有着广泛的应用。
在分子生物学研究中，有很多的方法和技术可以用来解决问题，下面我们就一起来了解一下。
1. PCR技术PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种能够在试管中扩增DNA的技术。
它是创造性的方法，也是分子生物学领域中最重要的技术之一。
PCR技术在DNA的克隆、基因突变分析、DNA测序和基因表达分析等方面都有着广泛的应用。
PCR技术不仅能够扩增某一个基因的DNA序列，还可以同时扩增多个基因。
2. DNA芯片技术DNA芯片（DNA microarray）技术是一种高通量的基因表达分析技术。
它采用了DNA探针上的互补逆序列来检测样品中的RNA的含量。
DNA芯片技术可以同时检测大量基因的表达水平，从而了解集体基因表达模式的变化。
这种技术在肿瘤、遗传病、心脑血管疾病等方面的研究中都有着广泛的应用。
3. 蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术是一种用来分析蛋白质结构和功能的技术。
这种技术通过分析样品中的蛋白质，可以了解蛋白质的分子量、结构、功能等信息。
它是基于分子重量差异和氨基酸序列的分析方法。
蛋白质质谱技术在药物研发、代谢组学、蛋白质组学等方面的应用日益广泛。
4. 基因敲除技术基因敲除技术是一种用来破坏特定基因并研究这些基因功能的技术。
该技术通过利用针对该基因的RNA，以及CRISPR/Cas9蛋白质等工具，来破坏特定的基因。
基因敲除技术在遗传学、肿瘤学、药物研发等领域都有着广泛的应用。
5. 单细胞测序技术单细胞测序技术是一种可以针对单个细胞的基因组或转录组DNA测序技术。
这种技术可以检测一个基因在一个单独的细胞中的表达，从而了解细胞的类型和功能。
它在免疫学、发育学、神经科学等领域的研究中都有着广泛的应用。
分子生物学实验技术分类
分子生物学实验技术分类分子生物学实验技术是现代生物学研究中不可或缺的一部分，它涉及到对生物体内分子结构、功能和相互作用的研究。
这些实验技术在基础科学研究、医学诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。
在分子生物学实验技术中，根据其应用和原理可以进行分类，主要包括以下几类：1. 基因克隆技术，基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它包括DNA片段的定向克隆、质粒构建、DNA序列分析等。
通过基因克隆技术，研究人员可以将感兴趣的基因或DNA片段放入适当的载体中，进行进一步的研究和应用。
2. 蛋白质分离和纯化技术，蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能的研究对于理解生物学过程至关重要。
蛋白质分离和纯化技术包括凝胶电泳、亲和层析、离子交换层析等方法，可以将混合的蛋白质样品分离并得到纯净的蛋白质。
3. 核酸分离和检测技术，核酸是生物体内的遗传物质，包括DNA和RNA。
核酸分离和检测技术包括DNA/RNA提取、聚合酶链式反应（PCR）、原位杂交等方法，可以用于检测和分析生物体内的核酸序列。
4. 基因组学和转录组学技术，基因组学和转录组学技术是对生物体内所有基因组和转录组的研究，包括全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等方法，可以帮助研究人员全面了解生物体内基因的组成和表达模式。
5. 蛋白质-核酸相互作用技术，蛋白质和核酸之间的相互作用对于细胞内的生物学过程至关重要。
蛋白质-核酸相互作用技术包括免疫共沉淀、荧光共聚焦、电泳迁移变性等方法，可以帮助研究人员研究蛋白质和核酸之间的相互作用。
以上是分子生物学实验技术的一些分类，这些技术的不断发展和创新为生物学研究提供了强大的工具，也推动了生物医学领域的进步。
在未来，随着技术的不断进步，分子生物学实验技术将继续发挥重要作用，为人类健康和生命科学研究带来更多的突破和进展。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
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根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
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1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
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(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
分子生物学常用技术
用途：
RNA（甲醛、乙二醛等）
检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；
比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
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North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记)
⑤底物与抗体-HRP /AP反应, 显色或发光
③杂交：Dig 标记的探针与 靶DNA结合
底物
D│ D│
① 电泳,转膜， 紫外交联固定
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第一节
分子印迹与杂交技术
Molecular Blotting & Hybridization Technology
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一、核酸分子印迹与杂交技术 学习要求 1
印迹(blotting)
指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大 分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成 为固相化分子的过程。
①电泳分离,转膜, 固定蛋白于膜上
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②漂洗和封闭
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优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
缺点： 1.免疫反应性较低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
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2. Western Blotting间接法操作流程:
⑤底物与二抗-HRP/ AP反应, 显色或发光
• 用Western blotting检测样品中存在特异蛋白质 • 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 • 用于蛋白质分子的相互作用研究
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1. Western Blotting直接法操作流程:
④底物与抗体-HRP / AP反应, 显色或发光
分子生物学常用技术(简化版)
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列
标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
精品课件
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列
反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
精品课件
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高
精品课件
2. 非放探针的酶促标记
生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可 以参入探针
精品课件
3. 非放探针的化学标记
利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合
精品课件
四、如何进行杂交？
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等
与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行
标记方法
标记物
探针
缺口平移
同位素或半抗原DNA探针
随机引物标记 同位素或半抗原DNA探针
5’ 或3’ 末端标记 同位素
寡核苷酸探针
PCR标记 体外转录
同位素或半抗原DNA探针 同位素或半抗原单链RNA探针
化学标记
半抗原
均可
精品课件
1. 缺口平移
nick translation: 适用于标记双链 DNA 控制 DNase I 的 用量，可以控制 探针的长度
第四篇：分子生物学技术与应用
分子生物学常用检测技术
二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸
分子杂交
（molecular hybridization）。
核酸分子杂交的临床应用
• • • • •
1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定
或
2+
和
dCTP dGTP dTTP dATP 模板 引物
PCR的种类
• 荧光定量PCR
• 通PCR • 原位PCR
• 免疫PCR
• ……
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
R
5' 3'
probe
Q
3' 5' 3' 5'
5'
三、基因芯片技术
• 基质材料分， 有尼龙膜、玻 璃片、塑料、 硅胶晶片、微 型磁珠等。
用点样法固定 在玻璃板上的DNA 探针阵列
原位合成法在玻璃等 硬质表面上直接合成 的寡核苷酸探针阵列
基因芯片技术的应用
1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业
四、测序技术
（一）一代测序技术
平台期
指数增长期 循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测
弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究
用于遗传病的诊断
样本采集要求
项目
分子生物学常用的各种技术项目举例
环境。
溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，
尽量减少台面污染。
凝胶电泳原理-EB染色
核酸电泳的指示剂
• 核酸电泳常用的指示剂有两种：
•
⑴ 溴酚蓝
•
⑵ 二甲苯青，
溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；
二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝青色，它 携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移 率比溴酚蓝慢。
分子生物学常用技术
3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 P凝胶电泳技术
凝胶电泳(Gel electrophoresis)是分子克隆的中 心技术之一。
1. 琼脂糖凝胶用于分离200~1000bp的片段；
操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5~500bp的片段；
1. 放射性核素的标记 （1）切口平移法：该技术由Kelly等于1970年创立。是目前最常用 的一种脱氧核糖核酸的探针标记法。是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，从而 合成高比活的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋及带缺口的双链 DNA匀可作为模板。首先，极微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在 DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶的5`→3′核 酸外切酶活性在切口处将从旧链5`—末端逐步切除。同时，在DNA 聚合酶Ⅰ的5`→3′聚合酶活性的催化下，
基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探 针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针， cDNA探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。 1.基因组DNA探针： DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百 碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的科学领域。
它通过一系列研究方法和实验技术，揭示生物体内分子的组成，研究其在生物规律中的作用，为生物科学的发展和应用提供了有力的支持。
本文将介绍几种常见的分子生物学技术及其在科学研究和应用中的重要性。
第一种技术是聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一种能够快速、准确地复制DNA片段的技术。
通过PCR，可以从微量的DNA模板扩增出大量的DNA片段，为后续的实验提供足够的样本。
PCR的过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性过程中，DNA双链被加热分离为两条单链；在退火过程中，引物与目标DNA序列互补结合；在延伸过程中，DNA聚合酶通过合成新的DNA链。
PCR技术在基因克隆、基因检测和基因定量等领域得到广泛应用。
第二种技术是DNA测序。
DNA测序是确定DNA序列的方法。
通过对DNA分子进行测序，可以了解其中所包含的信息，以及基因在细胞中的功能。
测序的过程中，通常使用Sanger方法，也就是反复进行DNA聚合酶链式延伸反应，结果是生成一系列不同长度的DNA片段。
这些片段会被分离、检测和记录，得到DNA序列。
DNA测序技术对于遗传病的诊断和治疗、疾病基因的研究以及进化生物学的研究等有着重要意义。
第三种技术是凝胶电泳。
凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的方法。
凝胶电泳通过电场的作用，使带电粒子在凝胶基质中迁移，根据它们的大小和电荷进行分离。
凝胶电泳可实现DNA分子的分离和纯化，以及分析DNA片段的大小、形状和数量等信息。
凝胶电泳技术在基因分型、基因突变检测、DNA指纹鉴定等领域被广泛应用。
第四种技术是基因克隆。
基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化等方法使其复制。
基因克隆技术在分子生物学研究和基因工程中具有重要的应用价值。
通过基因克隆，可以扩大DNA 片段的数量，并将其引入到其他生物系统中进行研究。
分子生物学常用检测技术
分子生物学常用检测技术分子生物学是一门研究生物体内分子互动和功能的科学，其研究领域涵盖了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等。
这些领域的研究需要借助各种检测技术来实现，以下是几种常用的分子生物学检测技术。
1、基因测序技术：基因测序技术是测定DNA序列的技术，它可以直接读出基因序列，是分子生物学研究的重要工具。
基因测序技术可用于基因组学研究，解析物种的基因组结构和功能，也可以用于疾病的诊断和治疗。
2、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于快速、灵敏地扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
通过PCR，我们可以将微量的DNA片段进行数百万倍的扩增，从而可以进行后续的分析和检测。
PCR技术广泛应用于基因克隆、突变分析、疾病诊断等领域。
3、生物芯片技术：生物芯片是一种高密度DNA阵列技术，可以同时对大量基因进行检测和分析。
生物芯片技术可用于基因表达谱分析、基因多态性研究、疾病预测和诊断等。
4、质谱技术：质谱技术是一种用于分析生物样品中分子质量和组成的技术。
通过质谱技术，我们可以对蛋白质、多糖、脂质等生物分子进行定性和定量分析。
质谱技术广泛应用于蛋白质组学研究、药物发现、疾病诊断等领域。
5、细胞荧光染色技术：细胞荧光染色技术是一种用于观察细胞内生物分子活性的技术。
通过荧光染料对目标分子进行标记，我们可以在显微镜下观察到细胞内分子的分布和活性。
细胞荧光染色技术广泛应用于细胞信号转导、药物筛选等领域。
以上仅是分子生物学领域中的几种常用检测技术，实际上还有许多其他的实验技术和方法如核磁共振技术、双向电泳、免疫沉淀等等，这些技术的发明和发展都为分子生物学的研究提供了强有力的支持。
各种技术的选择和使用主要取决于研究目的和研究样本的类型。
随着科学技术的发展，未来的分子生物学检测技术将更加灵敏、高效和个性化。
分子生物学常用技术及其应用分子生物学是一门研究生物大分子结构和功能的科学，包括DNA、RNA 和蛋白质等。
分子生物学常用技术
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
分离原理 操作要点 优点 应用范围
（一）分离原理
电荷效应 分子筛效应
PAGE支持物
单体－丙烯酰胺(Acr) 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂－过硫酸胺(AP) 加 速 剂 － N,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
– Tm=4(G+C)+2(A+T)
延伸温度和时间
–70～75℃ (72 ℃) –<1kb, 1min; 3～4kb , 3～4min;
10kb,15min
常用分子生物学实验技术--整理
常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理常⽤的分⼦⽣物学实验技术：离⼼技术： 是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常⽤⽅法之⼀。
电泳（electrophoresis）：带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。
可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。
1.蛋⽩质的电泳： ⽤途：蛋⽩质的定量。
2.核酸的电泳： ⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。
那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。
蛋⽩质研究相关的技术： 1. 含量测定： 2. 结构的测定： （1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。
⽅法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。
检测肽段） （2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。
⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定： （1）酵母双杂交（YTH）： 假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。
检测⽅法： 将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合； 将蛋⽩Y与AD融合； 确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。
如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。
原理： 真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。
BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的基因转录。
即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。
——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性，通过检测转录因⼦是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。
（2）蛋⽩质芯⽚技术：⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。
⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多肽。
常见的分子生物学检验技术
常见的分子生物学检验技术常见的分子生物学检验技术包括PCR、Western blot、Northern blot、Southern blot、DNA测序等。
PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在试管中扩增DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶酶活性的特性，通过不断重复的循环反应，在体外合成大量的目标DNA。
PCR技术广泛应用于基因重组、基因突变检测、DNA测序等领域。
Western blot是一种分析蛋白质表达的常用技术。
它可以通过将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并使用特异性抗体检测目标蛋白质的存在和数量。
Western blot技术在生物医学研究中常用于研究蛋白质的变化、鉴定蛋白质亚型等。
Northern blot是一种检测RNA表达的方法，类似于Western blot。
它可以在RNA样品中检测特定的RNA序列，并用于研究基因表达调控、寻找新的RNA转录本等。
Northern blot技术已被更先进的技术如RT-PCR取代，但在某些特定情况下仍然有其应用价值。
Southern blot是一种检测DNA序列的技术。
通过将DNA片段在电泳中分离，然后用特异性探针与目标DNA结合，可以检测特定的DNA序列。
Southern blot技术在基因组学研究中常用于检测基因突变、DNA重组等。
DNA测序是一种确定DNA序列的技术，也是分子生物学中最重要的技术之一。
通过测序反应和测序仪的分析，可以准确地确定DNA 的碱基序列。
DNA测序技术在基因组学、遗传学、进化生物学等领域中有广泛的应用，为科学家们提供了大量的基因信息。
除了以上几种常见的分子生物学检验技术，还有一些衍生的技术，如RT-PCR、荧光定量PCR、原位杂交等。
RT-PCR是一种能够通过逆转录将RNA转化为DNA，并在PCR反应中扩增的技术，常用于研究基因表达调控。
荧光定量PCR是一种在PCR反应中利用荧光信号定量检测DNA或RNA的技术，具有高灵敏度和高特异性。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学是生物学的一项重要分支，它研究细胞分子机制、基因调控、遗传信息的传递、处理和表达等。
分子生物学实验技术是对分子生物学研究进行实验室操作和检测的方法与技术。
本文将从基础实验技术、基因克隆技术、基因表达技术、基因分析技术四个方面深入介绍分子生物学实验技术的相关内容。
一、基础实验技术在分子生物学研究中，藏龙卧虎的实验技术为实验的准确性和精细度提供了保障。
以下是分子生物学实验室常用技术的简介：1、聚合酶链式反应PCR技术是分子生物学重要的实验技术，通过PCR技术，能够将极少量的DNA 扩增为大量的DNA。
PCR在分子生物学中有广泛应用，包括基因片段的克隆、置换突变、基因型检测、DNA 测序等诸多方面。
PCR反应需要引物和DNA模板，引物和模板配合的合理性是PCR反应的关键。
PCR反应具体操作时需要根据引物的长度、Tm值、模板浓度、扩增片段长度等因素，进行优化以达到最佳扩增效果。
2、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种分离蛋白质的技术，可按照分子质量和电荷分离其中的成分。
蛋白质电泳具体操作时比较复杂，核心是电泳样品的制备和电泳条件的设置。
电泳样品的制备主要包括电泳缓冲液的配制、蛋白质提取、样品准备、蛋白质定量和蛋白质加样。
电泳条件的设置主要包括电泳槽的填充、初始电压、电泳时间、gel浓度等。
3、核酸电泳核酸电泳是一种分离核酸的技术，通过电泳将带负电的DNA/RNA片段从电泳起点移向电极终点，达到分离纯化的目的。
关键是电泳实验条件的设置，包括电泳缓冲液的配制、电泳时间、电压、电泳gel浓度和transfer buffer浓度等。
4、原位杂交法原位杂交法是研究DNA 和RNA 相互作用的一种方法。
该方法能够定量测定DNA或RNA与特定基因的结合能力，从而实现特定基因的检测与鉴定。
原位杂交方法的操作步骤主要包括制备标记探针、制备样品、加标记探针、定性分析、定量分析等。
此方法具有灵敏度高，特异性强等优点。
分子生物学常用技术资料
温 度 72 （℃）
94
高温变性 低温退火 适温延伸 形 成
1
2
3
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
55 22
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋
DNA 2
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR运行图
PCR结果的鉴定
• 通过凝胶电泳的方式来进行。
•PCR结合多态性分析
PCR扩增产物的多态性分析有2种情况： 限制片段多态性分析(A)、(B) 重复序列多态性分析(A)、(C)
PCR-限制片段多态性分析
重复序列多态性分析
• SSCP技术进行点突变的诊断
实时荧光定量PCR技术
电泳技术
electrophoresis technology
⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条 引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol， 以最低引物 量产生所需要的结果为好，引 物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会。
5ul 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 50ul
•加样：
单样本加样 多样本加样 加样的顺序
•PCR反应条件的设定：
预就性温度： 变性温度： 退火温度： 延伸温度： 总延伸温度： 94℃，5分 94℃，30秒 需要摸条件 72℃，30秒 72℃，15分
分子生物学常用的各种技术项目举例
核酸分子杂交实质是双链DNA的变性和具有同源 序列的两条单链的复性过程。
核酸分子杂交基本原理
变性
不同来源的 DNA分子
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
复性
来的，为一种聚合线性多糖分子。琼脂糖溶液冷
却形成的琼脂糖凝胶 Agarose gel呈网状结构，具 有分子筛效用，可作为DNA电泳介质。琼脂糖凝 胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。
•
经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼
脂糖 Low melting point agarose ，其机械强度无
明显变化，但可被agarase水解。主要用于胶中
分子生物学常用技术
3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 P凝胶电泳技术
凝胶 心技术之一。
1. 琼脂糖凝胶用于分离200~1000bp的片段；
操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5~500bp的片段；
另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影 响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进 行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。
RNA甲醛变性凝胶电泳图像
3.2.1 核酸分子杂交基本原理 Nucleic acid hybridization
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放 在同一溶液中，只要在DNA或DNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成 杂化双链(heteroduplex) 。
RNA
DNA
杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是基因 组DNA,细胞总RNA或克隆的基因片段等。将标记的已知核酸片段 作为探针(probe)，与待测样本核酸进行杂交反应，即可观察到样本 核酸中相应的序列。 二、探针的种类与标记
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3’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5’
RNA引物 RNA引物
3’
5’ 引物酶 3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成 新链 延伸
3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
三、如何对核酸探针进行标记？
一、基本原理
变性(denature) 复性(renature) 杂交(hybiridization)
核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
一、PCR 的基本原理
在体外，以特定引物引 导，通过 DNA 聚合酶 选择性扩增特定区域 变性(denature)
退火(anneal) 延伸(extension)
DNA的体内复制
DNA解 旋解链
5’
3’
Байду номын сангаас
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋酶解链酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
Taq
Taq
Taq
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
第3轮扩增
重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 230=1,073,741,824
n 循环次数
理想拷贝数=2n
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA的体外扩增
1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸
5’ 3’
变性 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
加 热 退 火
复性
94℃
模板DNA
55℃
引物1
DNA引物
引物2
72℃
Taq酶
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
94℃
第2 1轮开始 轮结束
Taq
55℃ 72℃
引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)
引物设计原则
引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现 发卡结构
两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列
二、做 PCR 要有什么条件？
酶：Taq DNA 聚合酶
模板 DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反应的核苷酸单体 缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+
反应程序：变性、退火、延伸组成的循环
仪器：DNA 热循环仪，或称 PCR 仪
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
反 Northern 杂交：将探针 DNA 片段固定在杂交膜 上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交
第二节：聚合酶链式反应
PCR，polymerase chain reaction
在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的 合成手段和适合的酶而无法进行 1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖 全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为 重要的科学研究手段
1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探 针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测 人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素： 溶液的离子强度 变性温度与离子强度
正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列 标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素
dNTP
DNA聚合酶催化的聚合反应
1. 什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
热 循 环
温 度 72 （℃）
94
重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
DNA 解 链
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋 新链延伸
55 22
1
2
3
时间（min）
4
5
DNA的体外扩增
PCR反应体系
4种dNTP混合物 各200 µ mol/L 引物 各0.1-0.5 µ mol/L 模板DNA 0 .1 ～ 2 µ g Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L
有保真性的耐热 DNA 聚合酶吗？
Pfu DNA polymerase：
常用的高保真耐热 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 错误率约 1×10－6 适应于基因克隆
2. 如何设计寡聚核苷酸引物？
引物(primer)是 PCR 反应必备的前提，对 PCR 产物 类型、长度和反应的特异性具有决定作用
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时
分子杂交、PCR、基因测序
蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)
基因转移与基因剔除(含RNA干扰) 第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
第十九章
分子生物学常用技术
分子生物学技术能帮助我们干什么？
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高 可探测核酸含量，但无法得知分子大小
Southern blot
Edwin Southern 创立的方法 电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA 序列的长度 可进行毛吸管转移、真空转移与电转移
影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢 DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较 人类基因组C0t曲线
二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列
探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
电泳
转膜
杂交
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH
Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基 因的染色体定位
PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段 长度
引物设计原则
引物长度一般为 15~30 核苷酸 引物太短影响杂交体的稳定和特异性 引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降 GC 含量一般为 40％ ~ 60％ 应充分考虑退火温度(annealing temperature) GC 含量低，退火温度低，易出现非特异 GC 含量高，非特异性结合也会增加 引物解链温度粗略计算公式：
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等 与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行 缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度 显色 放射自显影/酶联显色
五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot Western blotting：不是杂交 原位杂交：in situ hybridization 反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能
DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能 目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段