分子生物学常用技术(简化版)
分子生物学常用实验技术及方法
分⼦⽣物学常⽤实验技术及⽅法
第⼆章常⽤实验技术及⽅法
⼀、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)
反应总体积为50 µl ，其中含有：
模板DNA 0.5 µl
PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl
10×MgCl 2 溶液 5 µl
dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl
引物1 (50 umol/L) 0.5 µl
引物2 (50 umol/L) 0.5 µl
Taq DNA 聚合酶 0.5 µl
⽆菌去离⼦⽔加⾄ 50 µl
上层⽤25 µl 液体⽯蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min
94 ℃变性1 min
56 ℃退⽕1 min
72 ℃延伸2 min
共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
⼆、基于PCR 技术的定点突变
1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下
游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所⽰）；
2. ⽤基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA ⽚段1，⽤基因3’端的Primer4和Primer 3⼀起PCR 扩增DNA ⽚段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA ⽚段1和
DNA
⽚段2；
3. 以⽚段1和⽚段2为模板，进⾏第⼆次PCR反应，反应体系为50 µl：
分子生物学常用检测技术
基因重组技术的应用
• 转基因植物
• （抗虫、抗冻、抗病、高产）
• 转基因动物
• 基因工程药物和疫苗
• 基因治疗
小结
分子生物学技术的临床应用
• 疾病的诊断
– 感染性疾病诊断 – 肿瘤性疾病诊断 – 遗传性疾病诊断 – 组织配型和器官移植
• 基因治疗 • 基因工程产品
– 转基因植物 – 转基因动物 – 基因工程药物和疫苗
和Βιβλιοθήκη Baidu
Taq DNA 聚合 酶
或
和
模板 引物
PCR的种类
• 荧光定量PCR • 通用引物PCR • 多重PCR • 巢式PCR • RT-PCR • 原位PCR • 免疫PCR • ……
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
probe
R
Q
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
Q
1. Polymerisation
EB 1.鼻咽拭子或体液标本。 2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
CMV 1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。 2. 其他体液标本或咽拭子。 3. 也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
TB
1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2021-04-23 11:01:29)转载▼
标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术根本实验室技术生物学实验教育
常用的分子生物学根本技术
核酸分子杂交技术
由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的根本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其根本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下〔适宜的温室度及离子强度等〕可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针〔probe〕,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交
固相杂交〔solid-phase hybridization〕是将变性的DNA固定于固体基质〔硝酸纤维素膜或尼龙滤膜〕上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交〔dot hybridization〕
是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后参加过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永别离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
常用分子生物学技术
Common Molecular Biology Technique
陈耕夫 生物化学与分子生物学系 基础学院 广东药学院
主要内容 一、分子杂交技术 二、目的基因制备技术 三、遗传修饰动物模型的建立 四、RNA干扰技术 五、蛋白组学研究常用技术
一、分子杂交技术
（一）什么是核酸杂交？ （二）核酸探针 （三）DNA杂交技术 （四）其他杂交技术 （五）生物芯片 （六）核酸杂交技术的应用
非同位素标记核酸探针检测原理
（二）核酸探针
3. 核酸探针标记的常用方法 放射性同位素标记法 如3H、32P、35S、125I等 非放射性标记法
半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明 配体：生物素 光密度或电子密度标记物： 金、银
（三）DNA杂交技术
DNA杂交技术是一种以DNA的特异序列（探针） 检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的 核酸杂交技术。
（四）其他杂交技术
2. Western印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测
的实验方法。 其过程与Southern印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼
龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离 的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异 性结合的蛋白质区带。
1. 在个体识别中的应用
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
基本过程： 组织细胞固定
预处理
杂交
冲洗
信号检测
42
第二节 PCR技术
聚合酶链式反应
polymerase chain reaction, PCR
43
PCR技术是生命科学领域中的一 项革命性创举和里程碑
广泛应用于临床医学、遗传咨询、 司法鉴定、考古、工业、农业及分子 生物学等各个领域
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
19
根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
③ 本方法得到的探针的长度较短，一般在400～
800bp.
④ 反应温度控制在14℃～16℃
(2)随机引物法（random priming)
原理：所谓随机引物（random primer)是含有各种排列 顺序的寡聚核苷酸片段的混合物，因此，它可以与任意 核酸序列杂交，从而扮演聚合酶反应的引物作用。
将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂 交，然后以与DNA探针片段杂交的寡核苷酸为引物，
分子生物学常用技术
②漂洗和封闭
16
后继的化学发光检测
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
Luminol化学发光原理
1/23/2020
17
（三）其他核酸杂交方法
1.斑点印迹杂交
将变性的DNA或RNA直接点样于NC膜或尼龙膜上， 故称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上 进行多个样品的检测。
用途：
RNA（甲醛、乙二醛等）
检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；
比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
1/23/2020
14
North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记)
⑤底物与抗体-HRP /AP反应, 显色或发光
③杂交：Dig 标记的探针与 靶DNA结合
底物
D│ D│
① 电泳,转膜， 紫外交联固定
原 理 和 过 程 与 Southern 印 迹基本相同，只是检测的分子 是RNA，可用来对组织或细胞中 的mRNA进行定性或定量分析。
1/23/2020
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Northern 与Southern blotting的异同点
相同点： 原理均为毛细作用
转移的是RNA
转移前无需酶切
常用分子生物学实验技术--整理
常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理
常⽤的分⼦⽣物学实验技术：
离⼼技术：
是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常⽤⽅法之⼀。
电泳（electrophoresis）：带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。
可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。
1.蛋⽩质的电泳：
⽤途：蛋⽩质的定量。
2.核酸的电泳：
⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。
蛋⽩质研究相关的技术：
1. 含量测定：
2. 结构的测定：
（1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。
⽅法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。检测肽段）
（2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。
⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定：
（1）酵母双杂交（YTH）：
假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。
检测⽅法：
将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合；
将蛋⽩Y与AD融合；
确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。
原理：
真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的基因转录。
常用分子生物学技术
PCR的基本原理类似于DNA的天然复制过程。是 以拟扩增的DNA分子为模板，一对分别与模板5′端和 3′端相互补的寡核苷酸为引物，以dNTP为原料，在适 当缓冲液中，由热稳定DNA聚合酶催化，对一对寡核 苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。
目录
基本反应步骤包括三步: ⑴变性（denaturation）通过加热至高于熔点温 度的条件下（94~95℃，30秒~1分钟），使DNA双螺 旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA作为模板。
目录
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源 性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分 析。为了扩增出单一的、特异性的DNA片段，所设计 的引物序列不能在模板序列中重复出现。这就是所 谓的引物序列的独特性。
（5）引物5′末端碱基：引物设计时可以在5′末 端加上限制性内切酶位点或其它短序列。
目录
（一）模板：
模板影响PCR效应主要有2方面因素。 1.模板的纯度：单链、双链DNA以及通过反转录
得到的cDNA都可以作为PCR反应模板。大多数用途
的PCR反应，对DNA模板的要求不太严格。 但不能
有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反应的物质存在。
2.模板DNA的量：模板DNA的用量，是依DNA性
质而定。对于质粒克隆的DNA，一般用纳克量ng；对
于染色体DNA，一般要到微克级μg。
分子生物学常用的各种技术项目举例
RNA
DNA
杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是基因 组DNA,细胞总RNA或克隆的基因片段等。将标记的已知核酸片段 作为探针(probe)，与待测样本核酸进行杂交反应，即可观察到样本 核酸中相应的序列。 二、探针的种类与标记
探针 (probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末 端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC（硝酸纤维素滤 膜）膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针的 选择与标记是杂交技术成功与否的关键。 (一)探针的种类
RNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探 针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 4.寡核苷酸探针: (人工设计，合成)
寡核苷酸探针具有一些独特的优点：
①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全 杂交的时间比克隆探针短。
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，这是因为短探针 中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
分子生物学常用实验技术
1 分子生物学常用实验技术
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定
第二章DNA 酶切及凝胶电泳
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第四章RNA 的提取和cDNA 合成
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第六章基因组DNA 的提取
第七章RFLP 和RAPD 技术
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第九章分子杂交技术
第十章测序技术
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定
第一节概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F 质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxedcontrol)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子,如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20 个以上,如Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20 多个扩增至1000-3000 个,此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术
包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成
一、DNA的化学合成 （无要求）－亚磷酸三酯法
DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的
合成的原理：
核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应
(1) 脱DMT游离出5′-OH 。(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验
技术。这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。在本文中，我将介绍常用分子生物学
技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应（PCR）：
PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。它
基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和
温度周期变化的条件下进行。PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学
研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：
凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。其中，
聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。在
电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差
异进行分离。凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的
分析和鉴定。
3.DNA测序：
DNA测序是确定DNA序列的技术。它通过测量DNA片段中的碱基顺序
来分析DNA的序列信息。目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术：
基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主
细胞中被表达。这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生
分子生物学常用实验技术.pdf
分子生物学常用实验技术
第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定
第二章 DNA酶切及凝胶电泳
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第四章 RNA的提取和cDNA合成
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第六章基因组DNA的提取
第七章 RFLP和RAPD技术
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第九章分子杂交技术
第十章测序技术
第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定
第一节概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
分子生物学常用检测技术
分子生物学常用检测技术
分子生物学是一门研究生物体内分子互动和功能的科学，其研究领域涵盖了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等。这些领域的研究需要借助各种检测技术来实现，以下是几种常用的分子生物学检测技术。
1、基因测序技术：基因测序技术是测定DNA序列的技术，它可以直接读出基因序列，是分子生物学研究的重要工具。基因测序技术可用于基因组学研究，解析物种的基因组结构和功能，也可以用于疾病的诊断和治疗。
2、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于快速、灵敏地扩增特定DNA片段的分子生物学技术。通过PCR，我们可以将微量的DNA片段进行数百万倍的扩增，从而可以进行后续的分析和检测。PCR技术广泛应用于基因克隆、突变分析、疾病诊断等领域。
3、生物芯片技术：生物芯片是一种高密度DNA阵列技术，可以同时对大量基因进行检测和分析。生物芯片技术可用于基因表达谱分析、基因多态性研究、疾病预测和诊断等。
4、质谱技术：质谱技术是一种用于分析生物样品中分子质量和组成
的技术。通过质谱技术，我们可以对蛋白质、多糖、脂质等生物分子进行定性和定量分析。质谱技术广泛应用于蛋白质组学研究、药物发现、疾病诊断等领域。
5、细胞荧光染色技术：细胞荧光染色技术是一种用于观察细胞内生
物分子活性的技术。通过荧光染料对目标分子进行标记，我们可以在显微镜下观察到细胞内分子的分布和活性。细胞荧光染色技术广泛应用于细胞信号转导、药物筛选等领域。
以上仅是分子生物学领域中的几种常用检测技术，实际上还有许多其他的实验技术和方法如核磁共振技术、双向电泳、免疫沉淀等等，这些技术的发明和发展都为分子生物学的研究提供了强有力的支持。各种技术的选择和使用主要取决于研究目的和研究样本的类型。随着科学技术的发展，未来的分子生物学检测技术将更加灵敏、高效和个性化。
分子生物学常用实验技术
分子生物学常用实验技术
1. PCR技术（聚合酶链反应）：能够扩增DNA的特定序列，用于检测、克隆和序列分析DNA。
2. 能量荧光素酶（Luciferase）报告基因：用于监测基因表达和调节，通过荧光素衍生物的反应来检测酶活性。
3. 免疫印迹（Western blot）技术：用于检测目标蛋白质的表达，并鉴定特定的抗原-抗体反应。
4. 基因芯片（Microarray）技术：可以同时测量大量基因的表达，用于研究基因表达的调节。
5. 基因组编辑技术（CRISPR-Cas9）：通过靶向修饰基因组来研究基因功能和治疗疾病。
6. 蛋白质亲和层析技术（Protein Affinity Chromatography）：用于分离和纯化蛋白质，常用于研究蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用。
7. RNA干扰技术（RNAi）：利用RNA分子靶向抑制目标基因表达的技术，常用于研究基因调节的机制。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术
分子生物学是生物学的一项重要分支，它研究细胞分子机制、基因调控、遗传信息的传递、处理和表达等。分子生物学实验技术是对分子生物学研究进行实验室操作和检测的方法与技术。本文将从基础实验技术、基因克隆技术、基因表达技术、基因分析技术四个方面深入介绍分子生物学实验技术的相关内容。
一、基础实验技术
在分子生物学研究中，藏龙卧虎的实验技术为实验的准确性和精细度提供了保障。以下是分子生物学实验室常用技术的简介：
1、聚合酶链式反应
PCR技术是分子生物学重要的实验技术，通过PCR技术，能够将极少量的DNA 扩增为大量的DNA。PCR在分子生物学中有广泛应用，包括基因片段的克隆、置换突变、基因型检测、DNA 测序等诸多方面。PCR反应需要引物和DNA模板，引物和模板配合的合理性是PCR反应的关键。PCR反应具体操作时需要根据引物的长度、Tm值、模板浓度、扩增片段长度等因素，进行优化以达到最佳扩增效果。
2、蛋白质电泳
蛋白质电泳是一种分离蛋白质的技术，可按照分子质量和电荷分离其中的成分。蛋白质电泳具体操作时比较复杂，核心是电泳样品的制备和电泳条件的设置。电泳样品的制备主要包括电
泳缓冲液的配制、蛋白质提取、样品准备、蛋白质定量和蛋白质加样。电泳条件的设置主要包括电泳槽的填充、初始电压、电泳时间、gel浓度等。
3、核酸电泳
核酸电泳是一种分离核酸的技术，通过电泳将带负电的
DNA/RNA片段从电泳起点移向电极终点，达到分离纯化的目的。关键是电泳实验条件的设置，包括电泳缓冲液的配制、电泳时间、电压、电泳gel浓度和transfer buffer浓度等。
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影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢 DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较 人类基因组C0t曲线
二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列
探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
热 循 环
温 度 72 （℃）
94
重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
DNA 解 链
DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋 新链延伸
55 22
1
2
3
时间（min）
4
5
DNA的体外扩增
PCR反应体系
4种dNTP混合物 各200 µ mol/L 引物 各0.1-0.5 µ mol/L 模板DNA 0 .1 ～ 2 µ g Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5mmol/L
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时
分子杂交、PCR、基因测序
蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)
基因转移与基因剔除(含RNA干扰) 第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
第十九章
分子生物学常用技术
分子生物学技术能帮助我们干什么？
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
反 Northern 杂交：将探针 DNA 片段固定在杂交膜 上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交
第二节：聚合酶链式反应
PCR，polymerase chain reaction
在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的 合成手段和适合的酶而无法进行 1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖 全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为 重要的科学研究手段
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能
DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能 目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段
我们需要了解和掌握哪些基本技术？
有保真性的耐热 DNA 聚合酶吗？
Pfu DNA polymerase：
常用的高保真耐热 DNA聚合酶 有5’ →3’ 外切活性 错误率约 1×10－6 适应于基因克隆
2. 如何设计寡聚核苷酸引物？
引物(primer)是 PCR 反应必备的前提，对 PCR 产物 类型、长度和反应的特异性具有决定作用
引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)
引物设计原则
引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现 发卡结构
两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列
放射性标记的核苷酸单体
dNTP or NTP 5’ or 3’ P32 labelling
非放射性标记物
特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及 放射性同位素 地高辛：通过地高辛抗体结合并检测 生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin) 化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光 电子密度标记物：金等重金属
Taq
Taq
Taq
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
第3轮扩增
重复30轮后 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 230=1,073,741,824
n 循环次数
理想拷贝数=2n
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
DNA的体外扩增
1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸
PCR 技术的特点
高度的灵敏性：理论上经 20 循环可将目的基因片 段扩增 220＝1000000 倍
高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可 保证扩增的特异性 一对 20 碱基长引物的多样性为440＝1024 应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不 可少的手段 操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等 与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行 缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度 显色 放射自显影/酶联显色
五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot Western blotting：不是杂交 原位杂交：in situ hybridization 反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高 可探测核酸含量，但无法得知分子大小
Southern blot
Edwin Southern 创立的方法 电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA 序列的长度 可进行毛吸管转移、真空转移与电转移
基本技术： 核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用 综合技术： 基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术 应用技术： 基因诊断 基因治疗
第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的 未知核酸序列 用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行百度文库量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
5’
3’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶 5’
RNA引物 RNA引物
3’
5’ 引物酶 3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
DNA的体内复制
DNA解 旋解链 引物 合成 新链 延伸
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’ 5’
5’ 3’
DNA 聚合酶 AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
3’ 5’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
DNA加热解链
PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段 长度
引物设计原则
引物长度一般为 15~30 核苷酸 引物太短影响杂交体的稳定和特异性 引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降 GC 含量一般为 40％ ~ 60％ 应充分考虑退火温度(annealing temperature) GC 含量低，退火温度低，易出现非特异 GC 含量高，非特异性结合也会增加 引物解链温度粗略计算公式：
Taq DNA polymerase
在 70~75℃ 范围活性最佳，每秒可延伸 150nt 95℃ 时的半衰期为 40 min 按变性时间 1 min 计，能满足 30 循环的反应 Taq 酶具有 5’ →3’ 聚合活性和 5’ →3’外切活性 不具备校读活性，错误率为 2×10－4 左右 错误合成的 DNA片段可以作为模板，循环数越 多，最终扩增产物错误率越高 只能用于检测，不适合基因克隆
一、PCR 的基本原理
在体外，以特定引物引 导，通过 DNA 聚合酶 选择性扩增特定区域 变性(denature)
退火(anneal) 延伸(extension)
DNA的体内复制
DNA解 旋解链
5’
3’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋酶解链酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
dNTP
DNA聚合酶催化的聚合反应
1. 什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多 目前常用 Taq DNA 聚合酶 纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列 标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg 常用的放射性同位素
一、基本原理
变性(denature) 复性(renature) 杂交(hybiridization)
核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探 针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测 人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
5’ 3’
变性 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
加 热 退 火
复性
94℃
模板DNA
55℃
引物1
DNA引物
引物2
72℃
Taq酶
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
94℃
第2 1轮开始 轮结束
Taq
55℃ 72℃
电泳
转膜
杂交
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH
Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基 因的染色体定位
变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素： 溶液的离子强度 变性温度与离子强度
正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
1. 缺口平移
nick translation:
适用于标记双链 DNA 控制 DNase I 的 用量，可以控制 探针的长度
2. 非放探针的酶促标记
生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可 以参入探针
3. 非放探针的化学标记
利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合
四、如何进行杂交？
二、做 PCR 要有什么条件？
酶：Taq DNA 聚合酶
模板 DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA 引物：人工合成的寡核苷酸片段 dNTP：聚合反应的核苷酸单体 缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+
反应程序：变性、退火、延伸组成的循环
仪器：DNA 热循环仪，或称 PCR 仪
3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
三、如何对核酸探针进行标记？