抗体ProteinA纯化方法

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抗体纯化的基本流程

抗体纯化的基本流程

抗体纯化的基本流程

一、引言

抗体是一种特殊的蛋白质,可以识别并结合到特定的抗原上。在生物医学研究中,抗体被广泛应用于诊断、治疗和基础研究等领域。抗体纯化是制备高纯度抗体的重要步骤之一,本文将介绍抗体纯化的基本流程。

二、前期准备

1.选择适当的来源:根据需要选择合适的来源,如小鼠、兔子等。

2.免疫原制备:根据需要制备相应的免疫原。

3.动物免疫:将免疫原注射到动物体内进行免疫。

三、收集血清

1.采集血液:在动物免疫后,采集相应量的血液。

2.离心分离血清:将采集到的血液离心分离出血清。

四、初步纯化

1.蛋白A亲和层析:将血清通过蛋白A亲和层析柱进行初步纯化。蛋白A是与IgG亚类结合较紧密的亲和素。

2.洗脱:通过改变pH值或盐浓度等条件,将与蛋白A柱结合的IgG 洗脱下来。

五、中期纯化

1.离子交换层析:将初步纯化后的IgG通过离子交换层析柱进行中期纯化。选择适当的离子交换树脂,使得IgG可以被结合并随后洗脱。

2.洗脱:通过改变盐浓度或pH值等条件,将与离子交换树脂结合的IgG洗脱下来。

六、后期纯化

1.凝胶过滤层析:将中期纯化后的IgG通过凝胶过滤层析柱进行后期纯化。选择适当的凝胶过滤树脂,使得IgG可以在某一分子量范围内被分离出来。

2.洗脱:将分离出来的IgG进行洗脱,并进行最终检测。

七、总结

抗体纯化是制备高质量抗体的重要步骤之一。本文介绍了抗体纯化的基本流程,包括前期准备、收集血清、初步纯化、中期纯化和后期纯化等步骤。在实际操作中,应根据具体情况选择适当的方法和条件,以获得高纯度的抗体。

单克隆抗体纯化工艺流程

单克隆抗体纯化工艺流程

单克隆抗体纯化工艺流程

单克隆抗体纯化工艺流程是一个复杂且精细的过程,主要涉及到细胞发酵培养后的处理以及后续的纯化步骤。以下是对这一工艺流程的详细解释。

首先,在细胞发酵培养结束后,会采用深层过滤或连续流离心深层过滤的方法来去除发酵液中的细胞及细胞碎片。这一步是至关重要的,因为它能有效地去除杂质,为后续纯化步骤提供高质量的上清液。

接着,上清液会进入纯化工艺。整个纯化工艺主要包括ProteinA亲和色谱、低PH病毒灭活、阴/阳离子交换色谱(或复合模式色谱)、除病毒过滤、超滤浓缩换液以及除菌过滤等步骤。

在ProteinA亲和色谱步骤中,利用抗体结构中的Fc区域能特异性结合色谱填料偶联配基ProteinA蛋白的特性,进行色谱分离。大部分杂蛋白等杂质因无法与色谱填料结合而流穿,而抗体则与ProteinA蛋白结合,随后以低PH溶液洗脱柱子,收集粗纯后的抗体,达到初步纯化的效果。

随后,阴离子交换色谱利用等电点的差异进行分离。病毒、HCP、DNA等杂质因PI相对较低,呈酸性,在较高PH条件下与填料结合,而抗体PI一般相对较高,呈碱性,直接流穿,从而达到进一步分离去除杂质的效果。

除病毒过滤则采用特定规格的滤膜,如20nm左右的滤膜,进行纳滤,截留病毒颗粒,而蛋白则顺利流穿,从而实现病毒的去除。

最后,经过超滤浓缩换液和除菌过滤步骤,即可获得高质量的抗体原液。这些步骤确保了抗体的纯度、活性和安全性,为后续的应用提供了保障。

整个单克隆抗体纯化工艺流程虽然复杂,但每一步都至关重要,不可或缺。它充分展示了现代生物技术的精细和高效,为抗体药物的研发和生产提供了坚实的基础。

蛋白a纯化抗体原理

蛋白a纯化抗体原理

蛋白a纯化抗体原理

蛋白A纯化抗体原理

引言:

蛋白A是一种来源于金黄色葡萄球菌的蛋白质,具有与免疫球蛋白(抗体)特异性结合的能力。蛋白A纯化抗体是一种常用的方法,用于从复杂的混合物中纯化特定的抗体。本文将介绍蛋白A纯化抗体的原理及其在生物科学研究中的应用。

一、蛋白A与抗体的结合原理

蛋白A与抗体的结合是基于它们之间的特异性相互作用。蛋白A通过与抗体的Fc区域结合,实现对抗体的捕获和纯化。Fc区域是抗体分子中的常规区域,与蛋白A结合的特异性使其成为抗体纯化的理想选择。

二、蛋白A纯化抗体的步骤

1. 样品制备:将包含目标抗体的混合物制备好,如细胞培养上清或血清。

2. 预处理:将样品进行预处理,如去除杂质和富集目标抗体。

3. 蛋白A亲和层析:将预处理后的样品加载到含有蛋白A的亲和层析柱中。蛋白A与抗体结合,其他非特异性蛋白质被洗脱。

4. 洗脱:通过改变洗脱缓冲液的条件,如改变pH值或离子强度,使蛋白A与抗体解离,从而洗脱目标抗体。

5. 纯化抗体:将洗脱的目标抗体进行进一步纯化和浓缩,以获得高纯度的抗体样品。

三、蛋白A纯化抗体的应用

1. 生物医学研究:蛋白A纯化抗体广泛应用于生物医学研究中,用于纯化和分析特定抗体,如单克隆抗体。

2. 诊断试剂:蛋白A纯化抗体可用于制备诊断试剂盒,用于检测特定疾病标志物或病原体。

3. 生物制药:蛋白A纯化抗体在生物制药中起到关键作用,用于纯化和生产重组抗体药物。

4. 免疫疗法:蛋白A纯化抗体可用于制备免疫疗法药物,如单克隆抗体疗法。

结论:

蛋白A纯化抗体是一种有效的方法,用于从复杂的混合物中纯化特定的抗体。通过蛋白A与抗体的特异性结合,可以实现对抗体的高效捕获和纯化。蛋白A纯化抗体在生物科学研究和生物制药领域具有广泛的应用前景,为相关领域的研究和应用提供了重要的技术支持。

抗体纯化方法

抗体纯化方法

抗体纯化方法

1. 引言

抗体是一类免疫蛋白,具有识别和结合特定抗原的能力。在生物医学研究和临床应用中,纯化高质量的抗体是非常重要的。抗体纯化方法可以去除杂质,提高抗体的纯度和活性,从而提高其应用效果。本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。

2. 凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质,将目标分子(如抗体)与较大分子(如蛋白质杂质)分离开来。

具体操作步骤如下:

1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。

2.使用缓冲液进行洗脱,使较大分子无法通过凝胶柱而流出。

3.目标抗体由于分子大小适中,能够通过凝胶柱被保留下来。

4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来,得到纯化的抗体。

凝胶过滤层析法的优点是简单易行,不需要特殊设备,且适用于各种规模的实验室。但其缺点是分离效率较低,只能实现较为粗略的纯化。

3. 亲和层析法

亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。

具体操作步骤如下:

1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体(如蛋白A、蛋白

G等)的亲和层析柱中。

2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。

3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。

4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来,得到纯化的抗体。

亲和层析法具有高选择性和高效率的优点,能够得到高纯度的抗体。但其缺点是需要特定的亲和剂和配体,成本较高。

4. 离子交换层析法

离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。

Protein A Resin纯化抗血清

Protein A Resin纯化抗血清

Protein A Resin(Cat.No.L00210)纯化抗血清操作程序

1实验原理

Protein A亲和层析介质是纯化和分离IgG常用手段。Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白,主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然Protein A有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组Protein A包含5个高IgG结合域(Ka=108/M),并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。目前,Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明,Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域,而不影响Fab片段和抗原的结合。

Protein A Resin(Cat.No.L00210)的特性

Resin 体积5ml(10ml含5ml浆液)

配体 E.coli表达的重组链球菌Protein A

每个配体结合IgG位点的数目 5

配体的分子量约34kDa

配体的PI 5.17

配体密度≈2mg重组蛋白A/mlresin

静态结合能力大于20mg猪IgG/ml Resin

基质4%琼脂糖凝胶

颗粒大小90µm(45-165µm)

储存液含20%乙醇的1XPBS

储存条件4-8℃

有效期未开封前可保存12个月

2实验试剂和器材

2.1实验试剂

Na2HPO4、NaCl、甘氨酸、浓盐酸、Tris、蒸馏水、20%乙醇

2.2实验器材

Protein A Resin(金斯瑞生物科技L00210)、4℃冰箱、PH计或PH试纸、锥形瓶、量筒、漏斗、移液器、tip头、试剂瓶、0.22µm滤膜、注射器、纯化柱(约10ml)

常用抗体纯化方法

常用抗体纯化方法

常用抗体纯化方法

抗体经制备后需要进一步纯化,纯的抗体有利于保存以及排除杂蛋白对结果的影响。抗体纯化方法的选择一般取决于抗体的来源、时间的需求、成本的预算以及抗体的最终用途等。

根据纯化方式可分为以下几类:

1、亲和层析法

亲和层析主要适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图所示,琼脂糖首先与介质偶联,结合成具有特异亲和性的分离介质,再加入成分复杂的混合物即样品后,配体选择性吸附生物活性物质(高亲和力抗体),加入平衡液,洗脱去除杂质,最终获得目标物。

protein A/protein G亲和层析

通过基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A和protein G结合到柱料上,通过亲和层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

● protein A:分子量为42kDa,由spa基因编码,具有5个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由3个α螺旋构成。

Protein A的各个结构域

● protein G:分子量为65kDa,由spg基因编码,可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点,仅保留Fc结合结构域,其结合力较protein A更强。

Protein G的各个结构域

● protein A/protein G:是一种基因工程结合蛋白。它由4个protein A和2个protein G免疫球蛋白结合域组成,比单独的protein A或protein G结合范围更加广泛,并将其优点融为一体,几乎可以应用于所有种属的IgG纯化。

protein A HP使用

protein A HP使用

1.产品简介

Protein A能特异性地与抗体的Fc区结合,所以ProteinA亲和介质可用于抗体(单抗或多抗)的分离纯化,经过一步亲和层析,即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。本中心开发的琼脂糖亲和介质(Protein A)以琼脂糖凝胶为基质,以重组Protein A 为配基,具有很高的物理化学稳定性,配基不易脱落,寿命长,使用方便。

2.产品特性

3.应用

琼脂糖亲和介质(Protein A)广泛用于各种抗体的柱层析分离纯化。层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。

平衡:用5~10CV的平衡缓冲液(20mM PB+0.15M NaCl pH7.0添加适当浓度的NaCl 抑制非特异性吸附)平衡层析柱,至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。

进料:样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制;低浓度样品溶液可用平衡液透析;高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤(0.45um)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

淋洗:上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱:用洗脱缓冲液(20mM乙酸钠,pH3.0-4.0或0.1M甘氨酸,pH3.00洗脱,收集流出液。洗脱后,应立刻用碱性缓冲液(如1MTris/HCl,pH90将收集到的抗体溶液中和到中性,避免抗体失活,维持抗体的生物活性。

再生、原位清洗:介质使用数次(5-10次,具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关)后,需要对介质进行再生、在位清洗。

(1)用0.1M的乙酸或0.1M的乙酸/20%乙醇淋洗柱子3-5CV,然后用缓冲液洗到中性即可重复使用;

4种常用抗体分离纯化工艺介绍

4种常用抗体分离纯化工艺介绍

4种常用抗体分离纯化工艺介绍

抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离,最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。

纯化过程中需要去除的工艺相关杂质包括细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分,需去除的产品相关杂质主要包括抗体片段和聚集体。纯化过程还需具备足够的病毒灭活去除能力,以去除宿主细胞自身表达的内源病毒样颗粒和未及时发现的外源病毒。

大多数工艺利用ProteinA来捕获抗体,并利用了至少1个离子交换层析作

为精纯步骤,仅少数工艺使用了疏水、羟基磷灰石和分子筛层析等步骤。

下图中显示了一个常见的抗体纯化工艺。反应器收获液首先经过离心和过滤,去除细胞和细胞碎片,然后经过ProteinA层析捕获抗体,捕获后的抗体经低pH孵育后,通过两个离子交换层析进行精纯,然后进行病毒过滤,最后换液并调整抗

体浓度,得到抗体原液。

工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。这两个专属步骤与层析步骤一起,可大大降低原液中可能存在的病毒数目。

工艺中的低pH孵育和病毒过滤是两个正交的专属病毒去除灭活步骤。这两个专属步骤与层析步骤一起,可大大降低原液中可能存在的病毒数目。

抗体分离纯化工艺

其中最常用的四种纯化方法,也就是今天的主角“四大名捕”。我们接着往下看吧。

1、Protein A

从原核金黄色葡萄球菌细胞壁分离的结合受体Protein A(~56kDa)与不同免疫球蛋白同型的Fc区以及人VH3家族的Fab区具有高度的亲缘关系。进一步研究表明,Protein A仅限于与IgG亚类IgG1、IgG2和IgG4结合,与IgG3的反应性很低,约占总IgG的8%。天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域,结构示意图如下:

抗体纯化工艺

抗体纯化工艺

抗体纯化工艺

一、引言

抗体是一种重要的生物大分子,具有广泛的应用前景。在许多领域中,如医学、生物技术和生命科学等方面都有着重要的应用。抗体的纯化

是研究和应用这些分子的基础,因此抗体纯化工艺显得尤为重要。

二、抗体纯化工艺流程

1. 细胞培养及收获

细胞培养是抗体制备的第一步,通常使用哺乳动物细胞系来表达目标

蛋白。细胞培养条件包括温度、CO2浓度、营养成分和培养基等。当

细胞达到最大密度时,可以进行收获。收获后将细胞离心并取下上清液。

2. 亲和层析

亲和层析是最常用的抗体纯化方法之一。它利用特定配体与目标分子

之间的亲和作用,将目标分子从混合物中选择性地吸附到固相材料上。例如,使用含有蛋白A或蛋白G的树脂来选择性地捕捉IgG类别的抗

体。

3. 尺寸排除层析

尺寸排除层析是一种基于分子大小的分离方法。它利用不同分子大小

的抗体在树脂中的渗透性差异,从而实现对目标分子的纯化。尺寸排

除层析通常用于去除杂质,如细胞碎片、DNA和RNA等。

4. 离子交换层析

离子交换层析是一种利用不同离子性质进行分离的方法。在这种方法中,树脂表面上带有正负电荷的功能团能够与目标抗体中带有相反电

荷的部位结合。通过调节pH或盐浓度,可以实现目标抗体与树脂之

间的选择性结合和解离。

5. 亲水性交换层析

亲水性交换层析是一种基于溶液中物质亲水/疏水特性进行分离的方法。它利用具有不同亲水性质的树脂来选择性地捕捉和纯化目标抗体。

6. 逆流色谱

逆流色谱是一种高效液相色谱技术,在抗体制备中也有广泛应用。它

可以快速地分离和纯化目标抗体,并且可以在大量样品中进行高通量分析。

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化的方法有哪些

抗体纯化是一种将杂质和其他成分从混合物中分离出抗体的过程。采用不同的方法可以实现抗体的纯化,具体方法取决于纯化过程中抗体与其他成分之间的特定相互作用。

以下是常见的抗体纯化方法:

1. 亲和层析(Affinity chromatography):基于抗体与目标抗原之间的高特异性结合作用。可以使用结合在固定支持介质上的目标抗原来精确地捕获抗体。

2.蛋白A、蛋白G和蛋白L亲和层析:这些层析方法基于蛋白质和抗体之间的亲和性。蛋白A、蛋白G和蛋白L是一类结合在细菌细胞壁上的蛋白质,它们与抗体Fc区域的不同部位结合,因此可以用于从混合物中富集抗体。

3. 离子交换层析(Ion exchange chromatography):基于抗体与离子交换基质之间的相互作用来实现分离纯化。通过调节溶液的pH值,可以控制离子交换基质上的电荷,从而实现对抗体的选择性捕获。

4. 尺寸排阻层析(Size exclusion chromatography):通过根据抗体与其他分子的大小差异来实现分离纯化。大分子如抗体会快速通过填充在柱内的孔隙,而较小分子则会被孔隙所限制,因此可以通过尺寸选择性地捕获和纯化抗体。

5. 亲和吸附(Affinity adsorption):用于捕获抗体的固定介质上表面共价或非共价地固定目标抗原,然后将混合物通过固定介质,使抗体与目标抗原相互作用,并通过洗涤和再生步骤来清除杂质。

6.电泳分离:电泳是基于分子在电场中迁移速率的差异来实现纯化的方法。通过电泳可以将抗体与其他成分分离开来。

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式蛋白A磁珠结合抗体的洗脱方式如下:

1. 在室温下,将结合有IgG磁性微粒的EP管置于翻转混合仪或手工轻轻翻转,轻摇混匀约10分钟。

2. 进行磁性分离1分钟,弃去上清液。

3. 向EP管中加入1毫升清洗缓冲液,再次轻摇混匀,然后进行磁性分离1分钟,弃去上清液。

4. 重复上述步骤两次,以充分清洗掉抗体。

5. 在最后一个清洗步骤完成后,向EP管中加入洗脱缓冲液,然后轻摇混匀。

6. 将离心管置于磁分离器上,进行磁性分离1分钟。

7. 将上清液吸出并转移至预先加有25微升MTris-HCl pH9.0的离心管中。

在操作过程中要注意保证混合仪的混合均匀、洗涤充分以及避免使用高盐浓度的洗脱缓冲液等要点。在处理后也要妥善保管,保证实验室安全。

ProteinAProteinG与抗体的结合

ProteinAProteinG与抗体的结合

P r o t e i n A P r o t e i n G 与抗体的结合

集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]

ProteinA、ProteinG与抗体的结合

1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合

目前,约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上,可以特异性的和样品中的抗体分子结合,而使其他杂蛋白流穿,具有极高的选择性,一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白,如用于某些种属的IgA、IgM的纯化。

天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸,可以单一位点偶联于琼脂糖上,降低了空间位阻,增加了与IgG 的结合能力。蛋白A 与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型,而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。

2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合

蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白,为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A 的非免疫机

单克隆抗体纯化方法

单克隆抗体纯化方法

单克隆抗体纯化方法

以下是几种常见的单克隆抗体纯化方法:

1. 亲和层析:利用抗体与特定配体的亲和力进行纯化,例如使用Protein A 或 Protein G 亲和层析来捕获抗体。

2. 凝胶过滤层析:根据抗体分子大小进行分离,可以去除较小的杂质。

3. 离子交换层析:基于抗体的电荷性质进行分离,适用于去除带电荷的杂质。

4. 疏水相互作用层析:利用抗体的疏水性进行纯化,可有效去除亲水性杂质。

5. 亲和洗脱层析:通过改变洗脱条件,如离子强度或 pH 值,从亲和层析柱上洗脱目标抗体。

6. 盐析和透析:通过在高盐浓度下沉淀杂质,然后通过透析去除盐分,实现抗体的纯化。

7. 超速离心:利用离心力将抗体与其他杂质分离开来,适用于大规模制备。

这些方法可以单独或联合使用,以获得高纯度的单克隆抗体。选择合适的纯化方法取决于抗体的特性和所需的纯度水平。

需要注意的是,在进行单克隆抗体纯化时,应严格遵循实验操作规程,并在适当的条件下进行质量控制和检测,以确保获得高质量的抗体产品。

28抗体的纯化——Protein A 、G、L亲和纯化

28抗体的纯化——Protein A 、G、L亲和纯化

Protein A /Protein G/Protein L亲和纯化抗体

Protein A具有和IgG的Fc片段结合的活性。Protein A能与大部分哺乳动物的IgG反应,不同属种的抗体对Protein A的亲和力不同;据此可将Protein A作为配基结合在琼脂糖凝胶上用于分离IgG亚类,一步纯化所得抗体的纯度大于99%;洗脱液的抗体浓度大于10 g/ L;适用于所有人源的(非IgG3)抗体和Fc融合蛋白。

Protein G不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合,且与白蛋白、α2-巨球蛋白相结合,这使得用Protein G亲和色谱提纯抗体,无法除去体系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前这一问题已经通过基因修饰的方法表达Protein G得以解决。

Protein L与蛋白A和蛋白G结合到(抗体)的Fc区不同的是,蛋白L通过轻链相互作用结合抗体。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用,蛋白L结合更宽范围的抗体类大于蛋白A或G蛋白,Protein L结合所有抗体类,包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。Protein L蛋白结合仅限于那些含有κ轻链的抗体,Protein L结合人的κI,III,IV和小鼠的κI 轻链亚型;Protein L还可以结合单链抗体和Fab片段。

SOP29 Protein A /Protein G/ Protein L亲和纯化抗体

1)血清预处理: 0.22孔径滤器过滤血清,与等体积PBS(pH7.4)混合,调至pH7.8,此时亲和挂柱效果较好。

2)平衡亲和柱:用10倍体积的PBS(pH7.4)清洗柱子,同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪进液口连接固定。

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式

protein a磁珠结合抗体的洗脱方式

全文共四篇示例,供读者参考

第一篇示例:

蛋白A磁珠(Protein A Magnetic Beads)是一种常用的蛋白结合亲和层析实验工具,能够快速、高效地富集含有His标签的蛋白。在分子生物学研究中,蛋白A磁珠通常与抗体一起使用,用于特异性地富集目标蛋白。

蛋白A磁珠结合抗体的洗脱过程在实验中起着至关重要的作用,直接影响到后续蛋白的纯化和分析结果。正确的洗脱方式可以保证蛋白的完整性和活性,提高实验的准确性和灵敏度。本文将介绍一些常用的蛋白A磁珠结合抗体的洗脱方式,希望能为相关实验提供参考。

一、低pH洗脱法

低pH洗脱法是最常用的蛋白A磁珠结合抗体的洗脱方式之一。在此方法中,可以使用含有低pH值的缓冲液(如乙酸、乙酸钠等)将蛋白A磁珠上的抗体洗脱下来。一般来说,将蛋白A磁珠悬浮于适当的低pH缓冲液中,并进行轻轻的振荡混匀,使抗体与磁珠分离。

需要注意的是,在低pH条件下,蛋白的稳定性可能会受到影响,部分蛋白可能会失去活性或变性。在选择低pH洗脱法时,需要针对不同的蛋白和抗体进行优化,并在实验过程中及时监测洗脱效果,以确保不影响实验结果。

二、高盐洗脱法

高盐洗脱法的优点在于操作简单、温和,对大部分蛋白的活性影

响较小。但需要注意的是,过高浓度的盐类可能会影响实验后续的应用,因此在选择高盐洗脱法时,需要针对具体实验要求进行优化。

三、竞争性洗脱法

竞争性洗脱法是一种新兴的蛋白A磁珠结合抗体的洗脱方式,相

对于传统的洗脱方法,竞争性洗脱法更具选择性和特异性。在此方法中,可以添加特定的抗体蛋白,使其与蛋白A磁珠上的抗体发生竞争

菜鸟入门,如何纯化抗体

菜鸟入门,如何纯化抗体

菜鸟⼊门,如何纯化抗体

抗体作为⽣物学上的⼀个有⽤⼯具已经超过⼀个世纪。19世纪70年代,抗体在研究和商业应⽤⽅⾯的使⽤取得了前所未有的进展。抗体最初是作为治疗病毒性疾病的天然抗⾎清来使⽤的。现今,⾼度⼯程化的治疗性抗体已被⽤于治疗多种危及⽣命的疾病。在这⾥我们将介绍纯化抗体的⼏种⽅法,尤其是单克隆抗体体的纯化。本⽂所介绍的⽅法是专为中⼩规模的抗体纯化总结,这些⽅法可通过⼿动执⾏或半⾃动仪器设备来完成。⼀种⽅法不可能适⽤于所有抗体,且任何⼀种抗体都可通过多种不同的操作⽅法进⾏纯化。

⼤多数实验室应该考虑选择⼀个纯化平台,每种⽅法都可以提供⼀个理想的结果。此外,还有不需要纯化的情况存在,如进⾏⼀项免疫电泳或者放射免疫扩散实验。在这些情况下只要包含合适的对照组,抗体的粗提物就能很好地⼯作。但是,对于临床前期试验中所使⽤的抗体,必须采⽤先进的多步的纯化程序来获得⾼度纯化的抗体。纯化步骤越多越复杂,纯化实验室越需要⾼效和经济。

⼀、通过沉淀进⾏部分纯化

⽤硫酸铵沉淀蛋⽩质是抗体部分纯化中最古⽼的⽅法之⼀,将饱和硫酸铵加⼊⾎清或者腹⽔中来沉淀抗体,通过离⼼分离沉淀与未沉淀的蛋⽩质。当⽤⽔溶剂将沉淀重悬后,所得的溶液即为富含抗体的液体;相⽐之下,使⽤⾟酸沉淀,⼤多数沉淀的蛋⽩质不是免疫球蛋⽩。此操作结束后,抗体存在于上清中。

1、硫酸铵沉淀。

(1)准备⼀份饱和硫酸铵(AS)溶液(4.lmol/L)(向⾎清或者腹⽔中加⼈等量的饱和AS溶液,此时溶液的饱和度达到50%,抗体将会被沉淀。

(2)沉淀前,2500r/min离⼼腹⽔或⾎清15~30min,使原液澄清,将⾎清或腹⽔转⼊⼀个清洁的烧杯中,放⼊⼀个磁⼒搅拌⼦,将其放置在磁⼒搅拌器上搅拌。

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抗体ProteinA纯化

一.P roteinA柱子的制备

1.配制溶液;

结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4,20mM ;PH8.0。

配制500ml的方法:

称取NaCl 4.383g,Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。

2. 制备空柱子

(1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。

(2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。

(3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。

(4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。

(5)加入5ml的ProteinA到柱子中。

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二.纯化步骤

1.样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。

2.平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。

3.上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。

4.洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。

5.收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。

测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活)

6.柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。

7.PBS透析收集的抗体。

三.试剂的制备

1. 结合缓冲液1000ml 500ml

甘氨酸112.6g 56.3g

氯化钠175.2g 87.6g

氢氧化钠调PH至9.0

2. 洗脱缓冲液500ml

甘氨酸7.507g

用盐酸调PH至3.0

3. 再生缓冲液500ml

甘氨酸7.507g

酸调PH至2.0

4.称取12.1gTris碱,加80毫升的双蒸水,溶解后用盐酸调节PH8.0,补加到水100毫升,

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