蓝萼甲素体外细胞毒活性研究_沈晓丹

收稿日期：2010－12－29基金项目：江苏省高校自然科学研究项目（10KJB350004）；苏州市科技支撑计划－社会发展项目（SS0933）；江苏省2010年高等学校大学生实践创新训练计划项目（5731506210）作者简介：沈晓丹（1986－），男，浙江嘉兴人，硕士研究生，研究方向：天然药物化学的教学、科研工作。

通讯作者：张健（1975－），女，辽宁盖州人，副教授，硕士研究生导师，研究方向：天然药物化学的教学、科研工作。

和中西医结合找到切入点和开拓新的思路。

参考文献［1］Developed by National Collaborating Centre for Chronic Condi-tions Royal College of Physicians ［EB /OL ］．Parkinson＇s disease ：full guideline DRAFT （2006）．http ：//www．nice．org．uk /page．aspx ？o =289461．［2］郑国庆，王小同，胡臻．脾阴学说的建立和发展［J ］．浙江中医杂志，2006，41（12）：683－685．［3］郑国庆．论养脾阴法治疗帕金森病［J ］．中国中医基础医学杂志，2008，14（3）：216－219．［4］曲明阳，战丽彬．滋补脾阴方药对衰老大鼠学习记忆能力的影响及脑内机制［J ］．中药药理与临床，2002，18（6）：32－35．［5］战丽彬，徐枫，董玉宽，等．滋补脾阴方药对老龄大鼠脑线粒体膜ATP 酶活性的影响［J ］．中药药理与临床，2000，16（1）：24－25．［6］尹德辉，王彩霞，李德新，等．脾阴虚证衰老大鼠心肌、脑组织mtDNA 缺失及滋补脾阴方药作用机制的实验研究［J ］．中医药学刊，2004，22（11）：2011－2012．［7］王彩霞，李德新，姜哲浩，等．理脾阴正方提高Alzheimer 痴呆模型动物学习记忆能力的机理探讨［J ］．辽宁中医杂志，2002，29（4）：242－243．［8］王彩霞，李德新，夏永良，等．理脾阴正方提高Alzheimer 痴呆小鼠抗氧化酶活性的研究［J ］．中医药学刊，2002，20（2）：214－215．［9］王彩霞，夏永良，姜哲浩，等．理脾阴正方对铝中毒大鼠海马超微结构的影响［J ］．辽宁中医杂志，2000，27（10）：477－478．［10］王彩霞，李德新．理脾阴正方对胆碱能神经影响的实验研究［J ］．中医药学刊，2001，19（2）：107－108．［11］Youdim MB ，Buccafusco JJ．Multi －functional drugs for vari-ous CNS targets in the treatment of neurodegenerative disorders ［J ］．Trends Pharmacol Sci ，2005，26：27－35．［12］刘国卿．神经元保护剂的研究进展［J ］．药学学报，2002，37：657－662．中华中医药学刊蓝萼甲素体外细胞毒活性研究沈晓丹1，曹莉1，董霞1，顾艳1，赵奉伦1，张健1，2（1．苏州大学药学院，江苏苏州215123；2．苏州利元医药科技有限公司，江苏苏州215011）摘要：目的：观察蓝萼甲素对正常肝细胞株（BRL ）、人白血病细胞株（Jurkat ）、人乳腺癌细胞株（SK －BR －3）、人结肠癌细胞株（SW480）、人肝癌细胞株Bel －7402、人胃癌细胞株SGC －7901、人白血病HL60、人淋巴瘤HUT －78、人喉癌hep －2、人宫颈癌hela 的细胞毒性作用。

方法体外培养条件下，用不同浓度蓝萼甲素分别处理1种正常细胞和9种肿瘤细胞株，MTT 法测定各细胞株的抑制率。

结果：蓝萼甲素对所选用的细胞株均具有较强的抑制活性，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。

结论蓝萼甲素具有较强的细胞毒性。

关键词：蓝萼甲素；细胞毒性中图分类号：R285．5文献标识码：A 文章编号：1673－7717（2011）06－1334－02Study on the Cytotoxic Effect of Glaucocalyxin A in VitroSHEN Xiao-dan 1，CAO Li 1，DONG Xia 1，GU Yan 1，ZHAO Feng-lun 1，ZHANG Jian 1，2（1．School of Pharmacy ，Soochow University ，Suzhou 215123，Jiangsu ，China ；2．Suzhou Liyuan Pharmaceutical Co．，Ltd ，Suzhou 215011，Jiangsu ，China ）Abstract ：Objective ：To investigate the cytotoxic effect of Glaucocalyxin A on the BRL ，Jurkat ，SK －BR －3，SW480，Bel －7402，SGC －7901，HL60，HUT －78，hep －2，hela cell in vitro．Methods ：MTT staining assay were used to assess the cytotoxic effects of Glaucocalyxin A on the ten kind cells．Results ：Glaucocalyxin A had a certain inhib-itory action on growth of cells．Conclusion ：Glaucocalyxin A have the strong cytotoxic effects in vitro．Key words ：Glaucocalyxin A ；the cytotoxic effect蓝萼甲素为香茶菜属植物———蓝萼香茶菜中的贝壳杉烷型二萜类成分，与抗肿瘤药物———冬凌草甲素具有相同的结构母核，文献报道，蓝萼甲素具有抗肿瘤活性，对艾氏腹水癌有一定抑制作用，体内对S 180实体瘤抑制率达30．4%（10mg /kg ，7天）［1］。

本研究对蓝萼甲素进行了体外细胞毒研究，旨在为蓝萼甲素在临床肿瘤治疗中的应用提供实验依据。

1材料与仪器1．1样品及试剂蓝萼甲素（Glu A ），自制，HPLC ，面积归一化法测纯度为99%。

4331中华中医药学刊RPMI －1640培养基（GIBCO 用前加入HEPES 1g ，NaHCO 32g ，L －谷氨酰胺0．292g 混匀，加适量双蒸水溶解定容至1L ，调节PH 至7．2 7．4，过滤除菌），NaHCO 3（上海虹光化工厂），HEPES （Beyotime ，ST091），L －谷酰胺、NaCl 、KCl 、KH 2PO 4、Na 2HPO 4均为国药集团化学试剂，新生牛血清（上海洛神生物技术有限公司），胰蛋白酶（Beyo-time ，CO201），四甲基偶氮盐（MTT ，Biosharp．414．3，用前将MTT 按5mg /mL 溶于PBS 溶液中，过滤除菌。

）二硫亚砜（BIOSHARP．LOT2071/12），盐酸SDS （Beyotime 、WT073）。

1．2实验细胞株实验细胞株均购自上海细胞所。

将贴壁细胞株（肝癌Bel －7402，肝正常细胞，妇科肿瘤Hela ，乳腺癌SK －BR －3，结肠癌SW480，胃癌SGC －7901，喉癌Hep －2）、悬浮细胞株（淋巴癌Hut －78，白血病Jurkat ，白血病HL －60）常规培养于经过改良的1640培养基，pH7．2－7．4，含10%新生牛血清，置37ħ，5%CO 2的培养箱中培养。

1．3仪器细胞培养箱（HF151UV ，Heal Force Develop-ment Ltd．）、单人双面净化工作台（SW －CJ －1F ，苏州净化设备有限公司）、倒置式生物显微镜（XDS －1A ）、酶联免疫检测仪（StatFax －2100，美国），微量振荡器（MH －2，海门其林贝尔仪器制造有限公司），台式离心机（KA －1000，上海安亭科学仪器厂），自动双重纯水蒸馏器（SZ －93，上海亚荣生化仪器厂），移液枪（Thermo Labsystems ），细胞计数板（XB －K －25，沪02270113），立式压力蒸汽灭菌锅（9LS －B50L ，上海华线核子仪器有限公司）。

2方法［2］2．1药物浓度设置及分组采用梯度稀释法将蓝萼甲素用培养基分别稀释至浓度（μg /mL ）为0．1、0．4、1．6、6.4μg /mL 进行给药。

同时设立空白对照组，调零组，每组各设置6个复孔。

2．2贴壁细胞培养及MTT 实验收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至10000/孔（细胞密度105个/mL ），铺于96孔培养板，每孔加入100μL ，调零孔不加细胞。

5%CO 2，37ħ孵育24h ，细胞单层铺满孔底。

吸出原培养基后，根据分组分别加入含有不同浓度药物的培养基，每孔100μL 。

空白对照组加入等体积的无药培养基。

5%CO 2，37ħ孵育24h 。

去除原培养基，并用PBS 洗板2次，每孔（除调零孔）加入10μL MTT 溶液，培养基90μL ，37ħ孵育4h 。

弃去培养液，每孔（包括调零孔）加入100μL DMSO ，置微型振荡器上震荡10min ，30min 内用酶联免疫检测仪于490nm 处测定其吸光度值。

计算各组吸光度值平均值，并根据下列公式计算抑制率：抑制率=（A 空白－A 给药）/A 空白ˑ100%，并根据抑制率，利用IC50计算软件计算IC50值。

2．3悬浮细胞培养及MTT 实验收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度至100000/孔（细胞密度1ˑ106/mL ），细胞悬液50μL ，含药培养基50μL 共100μL 铺板于96孔板中，调零孔不加细胞，空白对照组加入100μL 无药培养基。

置37ħ，5%CO 2孵育24h ，倒置显微镜下观察。

离心（3000r /min ，10min ），小心吸掉上清，每孔（除调零孔）加入10μL MTT 溶液，培养基90μL 继续培养4h 。

培养4h 后，每孔（包括调零孔）加入盐酸SDS100μL ，置于培养箱中放置过夜（约12h ）。

用酶联免疫检测仪于490nm 处测定其吸光度值。

计算各组吸光度值平均值，并根据下列公式计算抑制率：抑制率=（A 空白－A 给药）/A 空白ˑ100%，并根据抑制率，用IC50软件计算IC50值。

2．4统计分析各组实验数据用均数ʃ标准差（珋x ʃs ）表示。