荧光定量PCR实验设计及优化_lxm概要

• 相对定量分析中内参基因一般Hex标记 (例如Roche的UPL相对定量解决方案)
• 对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性) 扩增效率较差的建议Fam标记
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Reaction Conditions
Primers and Probes
Concentration Range (final con.) • Primers: 0.1 µM – 1.0 µM each • Probes: 0.1 µM – 0.5 µM Standard Concentrations (final conc.) • Primers: 0.5 µM each • Probes: 0.2 µM
荧光定量PCR实验设计及优化
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PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计 核酸纯化与逆转录
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PCR引物与探针
长度 序列 16 - 24 bases（引物） 不能有以下情况： 任意2个引物或探针之间的序列互补 引物或探针本身有二级结构
连续的> GGG，引物的5’端有G

melting curve (杂交探针等模式): 突变检测或亚型分析
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Standard Conditions in PCR
Template Primers Probes Controls
DNA or cDNA 0.5 µM each (final concentration) 0.2 µM each (final concentration)
Template Concentration: genomic DNA
plasmid DNA RNA cDNA and 1:100 dilutions
建议测试多个稀释度 (最少2个梯度,10^2) 50 ng - 5 pg
approx. 106 copies ≤ 500 ng total RNA or 100 ng mRNA ≤ 50 ng equivalent of total RNA ，RT product undiluted, 1:10
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Basic Optimization:
MgCl2 Titration
• MgCl2 Titration: 2 - 5 mM
• Format: SYBR Green I • LC FastStart DNA Master
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Basic Optimization:
Template Concentration
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PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计
核酸纯化与逆转录
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建立新的PCR体系:
General Hints
模板 - DNA或 cDNA 为模板
对照 - NTC (no template control) 每个探针引物组合 - 阳性对照 (如果可能) 分析 - 扩增: sensitivity and efficiency of PCR (crossing points) - 熔解曲线分析 (SYBR Green I format):检测引物二聚体或其 它非特异性扩增 凝胶电泳: 验证非特异性扩增


NTC (no template control) for each primer pair positive control (if available)
MgCl2 Concentration: 2 - 5 mM
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Basic Optimization in PCR
Use any template nucleic acid (NA) suitable for PCR, sufficiently purified and free of PCR inhibitors
模板浓度过高会抑制PCR
NTC sample 1 sample 1 sample 2 sample 2 original 1:1 0 original 1:10
Template DNA
undiluted and 1:10 dilution
Format SYBR Green I LIghtCycler® DNA Master
NA Storage Store nucleic acids in high concentrations and aliquots For low template concentrations, use siliconized tubes and add carrier NA (10 ng/µl), e.g. MS2 RNA
Design
primer design software，选择序列保守区域
如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入
LNA提高Tm
探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭 taqman探针
简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的
Tm高低
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PCR引物与探针
• SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记
引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C 引物3’端最后1个碱基为A
GC含量
40 - 60 % GC GC/AT分布大致均衡,C含量>G
65－70°C
探针复性温度
引物复性温度
60－65°C
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PCR引物与探针
标记 PCR产物长度 淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ, 不要用tamra 50－150bp
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来自百度文库
SYBR Green I Format PCR Analysis Example
模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体
Quantification
Melting Curve Analysis
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Optimization:
Influence of PCR Inhibitors
Example: Universal ProbeLibrary assay
• Higher primers/probe concentrations give better signal to noise ratio (higher fluorescence signal intensitiy)
• Only minor influence on Cp when used in medium concentration ranges