蚜虫基因组DNA提取方法的改进

蚜虫基因组DNA 提取方法的改进

3

杨子祥　陈晓鸣33

　冯　颖　缪迎春

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所　云南昆明　650224)

Method improvement for extraction genomic DNA from aphids .Y ANG Z i 2X iang ,CHE N X iao 2Ming 33

,FE NG Y ing ,MI AO Y ing 2Chun (Research Institute o f Resource Insects ,Chinese Academy o f Forestry ,K unming Y unnan 650224,China )

Abstract The traditional S DS method was m odified for the is olation of the genomic DNA from aphids with small body and surface covered by ex oskeleton.C ompared with the traditional S DS method ,this simple and effective method av oids grinding tissue and is suitable for the extraction of DNA from single aphid.G enomic DNA prepared by this new method is suitable for PCR amplification using RAPD random primers and sequencing primers.K ey w ords aphid ,genomic DNA ,extraction ,improvement

摘　要　蚜虫基因组DNA 的提取是蚜虫分子生物学研究中的难点。参照动物基因组DNA 的提取方法,根据蚜虫体型微小,体表有外骨骼的特点,对S DS 法作了改进。改进的方法无需用组织捣碎棒破碎虫体,操作简便。与现在常用的提取方法相比,改进的S DS 法能快速、有效地提取单头蚜虫的基因组DNA ,适用于RAPD 随机引物和测序引物的PCR 扩增。关键词　蚜虫,基因组DNA ,提取方法,改进

3科技部基础性研究项目(2000DE B100035)。33通讯作者

收稿日期:2005212227,修回日期:2006201212

运用分子生物学技术从核酸水平研究昆虫的分类和鉴定、生物型的识别、遗传多样性分析等,是现代昆虫分子系统学和昆虫遗传学的研究热点之一,开展这类研究的基础工作是基因组DNA 的提取

[1]

。在昆虫分子遗传学研究中,

由于研究的样本量较大,除了要获得质量和数

量合乎要求的DNA 外,还需要提取方法简便易行,容易掌握,成本较低

[2]

。

蚜虫是一类分布广,寄主广泛,经济价值较高的昆虫,世界上已知种类为4000多种[3]

,我

国已报道的种类1000余种

[4]

。蚜虫大多数是

害虫,它们刺吸植物汁液,直接影响植物生长,

同时间接传播病毒病害,造成农业上的损失,如棉蚜Aphis gossypii 、麦长管蚜Macrosiphum avenae 等;少数种类如五倍子蚜虫(倍蚜)是重要的资源昆虫,具有较高的经济价值

[5]

。蚜虫身体微

小,形态特征不显著,生活习性复杂,并具有多型多态现象,在分类和鉴定、近缘种的识别等方面,传统的研究方法往往难以发挥作用

[6]

。分

子遗传标记具有稳定性高、受环境条件影响小,

信息含量丰富等优点,非常适合于蚜虫的研究[7]

。蚜虫基因组DNA 的提取是开展蚜虫分

子遗传学研究的难点,Black 等采用了S DS 法提

取蚜虫基因组DNA 并用于RAPD 扩增[8]

;杨效文等在烟蚜Myzus per sicae (Sulzer )的研究中采用K AC 法提取烟蚜的DNA

[9]

;安瑞生等对K AC

法做了改进[10]

;以后的蚜虫研究人员大多采用

这种方法[11]

。近十几年来,蚜虫分子生物学研究有了较大的发展,但对蚜虫DNA 提取方法进行探索和比较的研究较少。

本试验尝试和比较了上述几种方法,并以

动物基因组DNA 的提取方法为基础[12]

,根据蚜虫体型微小,体表有几丁质外骨骼的特点,对S DS 法作了改进,改进的方法无需用组织捣碎棒破碎虫体,操作简便,能快速、有效地提取单头和多头蚜虫的基因组DNA 。

1　材料和方法

111　材料的来源

供试倍蚜样品中除肚倍蚜采自陕西西乡处,其余均采自四川蛾眉(表1)。在野外采集相隔115m以上、接近成熟但尚未爆裂的倍子,带回室内打开,将孤雌胎生有翅或无翅成蚜转移到115m L离心管中,无水乙醇浸泡,-20℃保存。

表1　材料来源(2004)

材料名称采集时

间(月)

虫态

(成蚜)

角倍蚜

Schlechtendalia chinensis(Bell)10

有翅Π无翅

倍蛋蚜

S.peitan(Tsai et T ang)8

有翅Π无翅

肚倍蚜

Kaburagia rhusicola T akagi 6

有翅Π无翅

肚倍枣铁亚种

K.rhusicola ensigallis(Tsai et T ang)6

无翅

倍花蚜

Nurudea shiraii M atsumura 8

无翅

红小铁枣蚜

M eitanaphis elongallis Tsai et T ang 6

无翅

112　主要仪器和试剂

基因公司UVP G DS28000凝胶成像分析系统(含LabW ork410图像分析软件分析),M J PTC2200PCR仪,Hermle台式高速离心机, Beckman DU800核酸蛋白质分析仪,Beckman CE Q8000DNA测序仪,上海天能ESP300电泳仪。

蛋白酶K(40UΠmg,Merck),G eneRuler100 bp DNA Ladder Plus(Fermantas),λDNA(48,502 bp,宝生物公司T akaRa),Tris饱和酚(天津灏洋),dNTP和T aq酶(Promega),引物由上海Sang on合成,其余试剂为国产分析纯。

113　基因组DNA提取

从浸泡液中取出蚜虫,置于无水乙醇、双蒸水中依次漂洗,吸水纸吸干,然后按下列方法提取。

11311　S DS法:参照田英芳等的方法[13,14],部分步骤有改动。将单个蚜虫转入115μL的离

心管中,加入100μL匀浆液(按A液∶B液∶C液=8∶1∶1配制。其中A液:Tris2Base0105m olΠL,NaCl011m olΠL,E DT A011m olΠL,pH=716;B 液:5%的S DS;C液:2mgΠm L蛋白酶K),用与离心管配套的组织捣碎棒充分研磨,再加入500μL匀浆液。45℃水浴1～3h,加入600μL 的Tris饱和酚,混匀,7000rΠmin,下同)离心10 min,取上清液。加入550μL氯仿∶异戊醇(24∶1),混匀,8000rΠmin离心10min,取上清液。加入1000μL冷无水乙醇(预置于-20℃), -20℃度冰箱内放置30min以上;12000rΠmin 离心10min,倾去上清液。加入500μL冷的70%乙醇(预置于-7℃),12000转离心10 min,倾去上清液。自然干燥后,加入20μL ddH2O溶解。

11312　改进的S DS法

参照动物组织基因组DNA提取方法[12],部分步骤有改动。将单个蚜虫转入115μL的离心管中,加入100μL匀浆液(按A液∶B液∶C液=25∶3∶2配制。其中A液:Tris2HCl10m olΠL, NaCl011m olΠL,E DT A1m olΠL,pH=810;B液: 10%的S DS;C液:10mgΠm L蛋白酶K)。将灭过菌的1m L枪头在酒精灯上烧一下,用其对蚜虫进行简单破碎。再加入500μL匀浆液,56℃水浴4h。加入600μL的Tris饱和酚,在摇床上缓慢摇晃20min后,7000rΠmin离心10min,取上清液。加入600μL氯仿∶异戊醇(24∶1),在摇床上缓慢摇晃20min后,7000rΠmin离心10 min,取上清液。加入600μL异丙醇(预置于-20℃),混匀,-20℃度冰箱内放置1h以上。12 000rΠmin离心10min,倾去上清液。加入600μL冷的70%乙醇(预置于-7℃),12000rΠmin 离心10min,倾去上清液。自然干燥后,加入20μL ddH

2

O溶解。

11313　K AC法:参照安瑞生等的方法[11]。将单个蚜虫转入115m L离心管中,加入20μL提取液A(Tris2HCl0105m olΠL,NaCl01025m olΠL, E DT A01025m olΠL,1%S DS),放置于-20℃冰箱4min后取出,用牙签捣碎,再加入100μL提取液A。65℃水浴45min,加入120μL提取液