荧光偏振技术原理课件
荧光偏振技术介绍
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原理：
当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。 如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。如图2.
图2 荧光偏振检测原理
任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因
素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。此外，荧光偏振所需的样品
荧光偏振技术介绍
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原理：
当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。 如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。如图2.
图2 荧光偏振检测原理
任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因
素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。此外，荧光偏振所需的样品
偏振荧光光谱原理
偏振荧光光谱原理
偏振荧光光谱原理详解
引言：
偏振荧光光谱是一种重要的技术手段，广泛应用于化学、物理、生物学等多个领域。通过对荧光信号的偏振特性进行测量和分析，可以揭示物质的结构、动态行为以及与周围环境的相互作用。本文将为您详细介绍偏振荧光光谱的原理和分析步骤。
第一部分：偏振荧光的基础知识
1. 光的偏振性
光是一种电磁波，其电场分量在空间中垂直传播方向的方向不同，可分为无偏振光、线偏振光和圆偏振光。线偏振光具有固定的电场振动方向，而圆偏振光的电场振动方向沿着垂直传播方向旋转。
2. 荧光光谱
荧光是一种物质在受到能量激发后，从高能级跃迁到低能级时放出的光。荧光光谱是荧光的波长分布，通常可由荧光光谱仪进行测量和记录。
第二部分：偏振荧光光谱的原理
1. 偏振效应原理
偏振荧光光谱的原理基于荧光分子在激发和发射过程中发生的偏振效应。激发光
通常是无偏振光，而发射光的偏振状态与激发光的偏振状态有关。通过测量和分析荧光分子产生的线偏振光的偏振特性，可以获得物质的结构和动态信息。
2. 偏振荧光的产生机制
荧光分子在受到激发后，电子从基态跃迁到激发态，并在激发态停留一段时间。在这个过程中，荧光分子与周围环境（如溶液、固体等）的相互作用引起偏振效应。这些相互作用包括取向效应、共振能量传输效应和旋转扭转效应。
3. 偏振荧光的测量与分析
为了获得物质的结构和动态信息，我们需要通过测量荧光的偏振特性。为此，我们可以使用偏振荧光光谱仪进行实验。该仪器可以通过包括偏振片和分光器在内的光学元件，对荧光信号的偏振度进行测量和分析。
荧光偏振技术原理
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
荧光偏振免疫分析原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理 Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.
➢ 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
1 1 ( 1 1)(1 RT ) P 3 P0 3 V
偏振值衡量荧光分子的运动性
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
荧光偏振分析方法
表面界面现象揭示
荧光偏振用于表面界面结构研究
利用荧光偏振技术可以观察材料表面和界面的微观结构，如表面形貌、界面层厚度等。
荧光偏振用于表面界面相互作用研究
通过荧光偏振技术可以研究材料表面和界面之间的相互作用力，如范德华力、氢键等，进 而理解材料的界面性能和稳定性。
荧光偏振用于表面界面反应动力学研究
荧光偏振技术可以实时监测材料表面和界面上的反应过程，揭示反应动力学规律和机理。
荧光偏振用于研究高分子聚 集态结构
荧光偏振技术可以揭示高分子在溶液或固体状态下 的聚集行为，如胶束、凝胶等的形成和演变过程。
荧光偏振用于高分子材料 性能表征
通过荧光偏振技术可以表征高分子材料的力 学性能、热学性能、光学性能等，为材料设 计和应用提供重要依据。
功能材料设计与优化
荧光偏振用于功能材料筛选
2
在药物评估方面，荧光偏振可实时监测药物与靶 标的相互作用，为药物优化和改造提供重要依据。
3
通过荧光偏振技术，可研究药物在细胞内的分布、 代谢和排泄过程，为药物作用机制研究提供有力 支持。
生物大分子相互作用研究
荧光偏振可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质DNA、蛋白质-RNA等生物大分子间的相互作 用，揭示生物过程的分子机制。
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05
荧光偏振在环境监
测领域应用
荧光偏振免疫分析PPT课件
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比 为10:1;
用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH≈6.6)稀释组蛋白溶液; 组蛋白浓度是DNA的10~500倍; DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后的组蛋白溶液共同保温
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对本实验室研究的思考
当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋白时，可以在核 酸的末端加上一个荧光标签,研究二者之间的结合关系,包括 结合常数,动力学参数等等。
推而广之，还通过核 酸等小分子研究蛋白 -蛋白复合物之间的 结合。
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2019/12/25
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论文的结构和主要内容
如果待测样本中竞争抗原含 量很少(低于检测限),荧光 标记抗原与抗体结合,FP值 较高(一般在150-300 mP) 。
而待测样本中竞争抗原的浓 度增加时,荧光标记抗原以 游离的形式存在于样本中 ,FP值便会下降,一般在3060 mP即为完全抑制
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FPIA是均相的竞争免疫 分析方法,反应完全在溶 液系统中,不需要分离结 合的和未结合的抗体。
实验操作过程非常简单, 仅仅是将抗体,荧光标记 的抗原和抗原加入到反应 杯中,经过几分钟甚至是 几秒钟的温育便可直接测 量,很快得到被测抗原的 浓度。
荧光偏振免疫分析PPT课件
非美国
15000+/120 >2000/>20 >2500/>12 >5000/>200 >1000
0+/1200+ 00
5
0/200
Roche 2010/1010/ E170
600/200/50
4000/2000/ 300
20000
18000 16000 14000
全球自动化免
12000
美国
10000 8000 6000
90 80 70 60 50 40 30 20 10 20
0 1994
44 1996
48 1998
49 2000
80 2002
AxSYM可提供之分析项目
肝炎/爱滋 甲肝抗体-IgM 甲肝抗体 甲肝抗体(定量) 乙肝表面抗原确证 乙肝表面抗原 乙肝表面抗体(定量) 乙肝核心抗体 乙肝核心抗体-IgM 乙肝e抗原 乙肝e抗原(定量) 乙肝e抗体 丙肝抗体(第三代) 爱滋抗体 艾滋抗原/抗体
非美国 总数
疫系统接受最多
4000
2000 0
AxSYM CentaurA/cAcCeSs1s8/I02mmulitVei/t2r0o0s02E0c1i0/1010/170
的仪器AxSYM :有近 20000台!
AxSYM®在全美的仪器拥有量最 多，大于4000台
荧光偏振技术原理共42页
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的ຫໍສະໝຸດ Baidu点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
荧光偏振技术原理
1、 舟 遥 遥 以 轻飏， 风飘飘 而吹衣 。 2、 秋 菊 有 佳 色，裛 露掇其 英。 3、 日 月 掷 人 去，有 志不获 骋。 4、 未 言 心 相 醉，不 再接杯 酒。 5、 黄 发 垂 髫 ，并怡 然自乐 。
谢谢！
荧光偏振免疫分析PPT课件
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标 记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的பைடு நூலகம்量。
第1页/共55页
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
生殖/内分泌 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 催乳素 睾酮
心血管急诊 肌酸激酶(MASS) 心肌钙蛋白-I 心肌红蛋白 同型胱胺酸酸 BNP
治疗药物 地高辛 茶碱 普鲁卡因 乙酰普鲁卡因酰胺 奎尼丁 卡马西平 苯巴比妥 丙戊酸 洋地黄 妥布霉素 庆大霉素 万古霉素 环孢霉素
5000 4000 3000 2000 1000
0
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
Source: Information Dynamics 2000
第9页/共55页
第10页/共55页
485nm 偏振光
第11页/共55页
485nm 偏振光
产生强偏振荧光 产生偏振荧光吗？
荧光偏振技术的原理和应用
荧光偏振技术的原理和应用
1. 荧光偏振技术的原理
荧光偏振技术是一种利用荧光现象来研究物质结构和性质的技术方法。它基于
光的偏振性质，通过测量样品对偏振光的吸收、发射和散射来获得有关样品特性的信息。
1.1 荧光现象的基础
•荧光现象是物质受到能量激发后，从高能级到低能级跃迁而放出的光。
•不同的物质具有特定的发射光谱，可以通过荧光光谱来确定物质的类型和组成。
•荧光现象受到分子结构和环境的影响，可以通过荧光偏振来研究分子的空间结构和动力学行为。
1.2 光的偏振性质
•光是一种横波，具有振动方向的偏振性质。
•偏振光的振动在一个特定的方向上，可以用偏振方向来描述。
•偏振光可以按照偏振方向分为线偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光。
1.3 荧光偏振技术的原理
•荧光偏振技术利用偏振光与样品之间的相互作用来获取信息。
•样品对不同偏振方向的光的吸收、发射和散射系数不同，可以通过测量偏振光的吸收、发射和散射来获得样品的偏振特性。
•通过测量偏振光的强度和偏振方向的变化，可以得到有关样品的结构、构型和相互作用的信息。
2. 荧光偏振技术的应用
荧光偏振技术在各个领域都有广泛的应用，可以用于研究材料科学、生物医学、环境科学等多个领域。
2.1 材料科学中的应用
•荧光偏振技术可以用于研究材料的结构、形态和性质。
•可以通过测量荧光偏振光的强度和偏振方向来研究材料的分子结构和晶体结构。
•可以用于研究材料的光学性质、电子结构和表面性质。
2.2 生物医学中的应用
•荧光偏振技术可以用于研究生物分子的构象和相互作用。
•可以用于研究生物分子的二级结构、三级结构和四级结构。
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Chem. Rev. 2010学, 习11交0流, P2P6T 85-2708.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
Anal. Chem. 200学9习, 8交1流, P7P4T68-7473.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
Polarized excitation
100% 0%
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<100%
>0%
4
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏振值的定义
P= +
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = 1；对于自然光，P = 0
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理
Biosens. Bioelectro学n习. 交2流01PP2T, 32, 148-154.
实时监测DNA双链的形成和解链过程
Nucleic Acids Re学s习. 2交0流0P3P,T 31: e70.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
Anal. Bioanal. Chem学. 习20交1流1P,P4T01, 3229-3234.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
5. 小分子分析
Chem. Commun. 20学1习2交, 4流8P,PT10004–10006.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
Anal. Chem. 20学12习,交8流4P, P5T535-5541.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 离子检测
特殊结构核酸增强荧光偏振
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
Analyst, 2012, 1学3习7交, 2流7P7PT0-2773.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振பைடு நூலகம்疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
荧光偏振免学习疫交分流析PP原T 理
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
超灵敏检测DNA
3. 核酸分析
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
Chem. Commun学. 习20交1流1P,P4T7, 3478-3480.
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案 ?
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 小分子检测
蛋白质增强荧光偏振
凝血酶 (thrombin)
不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光
偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均
相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
荧光偏振技术原理与 仪器及其应用
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荧光偏振技术原理与仪器及其应用
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
➢ 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
➢ 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
偏振值衡量荧光分子的运动性
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。