碱性蛋白酶水解乳清蛋白工艺条件的研究

5）水解产物分子质量分布测定：高效液相色 8%，在 以 上 确 定 的 最 适 温 度 、pH 值 条 件 下 ，分 别
谱法。
在 加 酶 量 16 000 U/100 mL、18 000 U/100 L、20
2.2 酶解工艺的研究方法
000 U/100 mL、22 000 U/100 mL 和 24 000 U/100
on antigenic content
试验结果表明，当酶解时间为 3 h 时，酶解产 物大多是分子质量分布在 200~2 000 Da 之间的多 肽，而游离氨基酸含量很少。 故选定最佳酶解时间 为 3 h。
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中国食品学报
2011 年第 1 期
3.6 正交试验 通过单因素试验，可以得到各因素的最佳值，
分数 8%，温度为本文 2.2.2 节中选定的最佳温度， 艺。 对水解温度（℃）、pH 值、加酶量、反应时间（h）
加 酶 量 16 000 U/100 mL，pH 值 分 别 为 6.0、7.0、 做四因素三水平正交试验。 抗原含量为 3 次平行
8.0、9.0 和 10.0，水 解 3 h，测 定 其 抗 原 含 量 ，找 出 试验的平均值。 试验因素和水平排列见表 1。
数 8%，pH 8.0， 加酶量 16 000 U/100 mL， 分别在 min，使碱性蛋白酶结构发生变化，达到不可逆失
45、50、55、60 和 65 ℃条件下水解 3 h，测定其抗原 活的效果。
含量，找出最适酶解温度。
2.2.7 酶解最优工艺条件的确定 以抗原含量为
2.2.3 酶解 pH 值的选择 乳清蛋白溶液的质量 考察指标，对水解条件进行优化，确定最佳酶解工
目 前 大 量 研 究 [1-2]证 实 婴 儿 配 方 奶 粉 中 的 乳 清 蛋白粉可使部分婴儿出现过敏症状，而其中的 β乳球蛋白是主要的过敏原。 母乳与牛乳在成分上 存在很大的差异。 母乳蛋白中的主要成分是乳清 蛋白，约占 70%，酪蛋白约占 30%；牛乳则与之相 反，主要蛋 白 为 酪 蛋 白 ，约 占 78.5%，乳 清 蛋 白 约 占 21.5%。 现代婴儿配方奶粉生产过程中，普遍使 用添加脱盐乳清蛋白粉的方法调节乳清蛋白和酪 蛋白的比例。 母乳和牛乳的乳清成分不同，母乳乳 清中主要是 α-乳白蛋白 （α-Lactalbumin，α-La）， 几乎没有 β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg），而 牛乳乳清中主要蛋白是 β-Lg （43%~50%）。 因此， 婴儿配方奶粉生产中， 添加脱盐乳清蛋白粉也导 致 β-Lg 含量的增加。
on antigenic content
由图 2 可知，当温度 55 ℃时，抗原含量最低； 55 ℃后， 由于碱性蛋白酶的稳定性下降， 酶被钝 化，酶解率降低。 故选定最适酶解温度 55 ℃。 3.3 最佳酶解 pH 值
pH 值对酶催化反应的影响包括两个方面，即 酶的稳定性及酶催化底物转变为产物。 分别在 pH 6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0 条件下测定酶 解 液 的 抗原含量，结果如图 3 所示。
170 150 130 110
90 70 50 30
5
6
7
8
9
10
11
pH 值
图 3 pH 值对抗原含量的影响 Fig.3 The effect of pH on antigenic content
由图 3 可知，在不同 pH 下，蛋白酶对 WP 的 水解作用不同。 当 pH 9.0 时，酶解液的抗原含量 最低；当 pH 值低于或高于 9.0 时，酶稳定性减弱， 酶活降低，酶解率下降。 因此碱性蛋白酶水解 WP 的最适 pH 值为 9.0。 3.4 最佳加酶量
4
3 结果与讨论
3.1 预热处理对酶解的影响 β-Lg 在一定温度和 pH 值范围可以保持二聚
体的天然构象，而当温度或 pH 值达到临界值时， 蛋白变性，天然构象发生变化，巯基和二硫键之间 发生交换， 包埋在天然结构内部的疏水侧链基团 暴露出来，使酶接触位点增加，水解速度加快。 在 80 ℃的条件下对乳清蛋白进行预热处理， 考查预 处理时间对抗原含量的影响，结果见图 1。
如何脱除 β-Lg，降 低 其 过 敏 性 ，是 目 前 很 多 乳品企业和科研院所的研究热点之一。 采用蛋白 酶水解 β-Lg 是目前较常用的方法。乳品企业根据 生产产品的不同，选用不同的蛋白酶进行水解。 该
收稿日期： 2010-03-02 作者简介： 石丹，男，1983 年出生，硕士，工程师 通讯作者： 云战友
从而确定每个因素的最佳试验范围， 再做正交试 验。 抗原含量见表 2，分子质量分布见表 3。
序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 极差 R
表 2 L9（34）正交设计方案及试验结果 Table 2 The L9（34） orthogonal design and results
140
130
120
110
100 90
80
70
60
0
10
20
30
40
50
60
预 热 处 理 时 间 /min
图 1 预热处理时间对抗原含量的影响 Fig.1 The effect of preheating time on antigenic content
的影响有两个方面， 即蛋白酶催化反应速度及稳 定性。 在一定温度范围，升高温度，底物转变成产 物的速度加快，酶解效率相应提高。 温度过高，酶 蛋白变性，酶的稳定性下降，酶解效率降低。 分别 在 45、50、55、60 和 65 ℃时 测 定 碱 性 蛋 白 酶 水 解
关键词 乳清蛋白； 水解度； 碱性蛋白酶； 抗原 文章编号 1009-7848（2011）01-0139-05
随着分离技术的进步， 从乳清蛋白粉中可分 离出乳清蛋白， 而乳清蛋白是目前婴儿配方粉的 主要原料。 与乳清蛋白粉 （whey powder，WP）相 比，脱除 β-乳球蛋白的乳清蛋白具有母乳化程度 高和低过敏性等优势， 因而必将代替 WP 成为今 后婴幼儿配方粉的重要蛋白原料。
2.2.1 预热处理对酶解的影响[5-6] 将质量分数为 mL 条件下水解 3 h，测定其抗原含量，找出最适加
8%的乳清蛋白溶液在 80 ℃条 件 下 分 别 处 理 10、 酶量。
20、30、40 和 50 min，然后酶解，测定其抗原含量， 2.2.5 酶 解 时 间 的 选 择 按 以 上 选 定 的 最 佳 参
方法除能有效去除 β-Lg 外，还能生成大量的生物 活性肽，且该法生产效率高，易于实现工业化等特 点。 本文选用碱性蛋白酶水解乳清蛋白，寻找最佳 水解工艺条件。
1 材料和仪器
1.1 材料 碱性蛋白酶 （Alcalase 2.4 L）， 活力，103 000
U/g， 丹 麦 诺 维 信 公 司 ； 乳 清 蛋 白 浓 缩 物 （WPC80）， 新西兰恒天然公司； 其它试剂均为优级纯或分析 纯。 1.2 主要仪器
紫外-可见分光光度仪（756PC 型）、电子天平 （BP211D 型）、自动电位滴定仪（785MP 型）、冷 冻 水浴恒温振荡器（LSHZ-300 型）、凯氏定氮仪（B324 型）、微电脑变频电磁炉（C-01 型）、高效液相 色谱仪（安捷伦 1200）。
2 试验方法
2.1 检验方法 1）酶活力测定：紫外分光光度法测定蛋白酶
当底物浓度一定， 增加酶量未使底物浓度饱 和时，加酶量越多，反应速度越快，蛋白质的水解
率越高。 但加酶量过大，生产成本相应提高，同时 也可能导致酶自身相互水解，使酶活力降低。 试验 结果如图 4 所示。
100 90 80 70 60 50 40 15000
17000 19000 21000 加 酶 量 /U·（100mL ）-1
从图 1 可以看出，预热处理 30 min，水解效果 最佳，超过 30 min，抗原含量反而升高。 这是因为 蛋白质受热变性，随受热时间而变化，时间过长， 蛋白质分子过度聚合，与酶接触位点减少，故预热 处理时间选定 30 min。 3.2 最适酶解温度
在蛋白质酶解过程中， 温度对酶解反应效率
抗 原 含 量 /mg·kg-1
第 11 卷 第 1 期 2011 年2月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 11 No． 1 Feb． 2 0 1 1
碱性蛋白酶水解乳清蛋白工艺条件的研究
石 丹 王彩云 云战友 * （内蒙古伊利实业集团股份有限公司 呼和浩特 010080）
过敏原含量 （10-6） 116 41 39 44 354 34 35 30 91
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抗 原 含 量 /mg·kg-1 抗 原 含 量 /mg·kg-1
抗 原 含 量 /mg·kg-1 抗 原 含 量 /mg·kg-1
WP 后的抗原含量，结果如图 2 所示。
100
90
80
70
60
50
40
45 50
55
60
65 70
酶 解 温 度/℃ 图 2 酶解温度对抗原含量的影响 Fig.2 The effect of enzymolysis temperature
最适 pH 值。
表 1 正交试验因素水平
Table 1 The factors and levels of orthogonal test 因素
A （温度 T/℃）
B （pH 值）
C 〔加酶量/U·（100mL）-1〕
D （时间/h）
1
50
8
19 000
2
2
55
9
20 000
3
3
60
10
21 000
找到其最佳预热处理时间。 酶解条件：温度（T）55 数，分别水解 2、3、4、5 和 6 h，测定其抗原含量，找
℃，pH 8.0，时间（t）3 h，加酶量 16 000 U/100 mL。
出最佳酶解时间。
2.2.2 酶解温度的选择 乳清蛋白溶液的质量分 2.2.6 灭 酶 活 将 水 解 液 在 90 ℃ 以 上 保 持 10
酶解时间主要依据酶解产物的分子质量分 布，当酶解产物为短肽时，易于人体消化吸收，此 时的酶解时间为最佳酶解时间。 不同酶解时间对 WP 水解的影响如图 5 所示。
90
85
80
75
70
Hale Waihona Puke Baidu65
60
55
50
45
40
1
2
3
4
5
6
7
时 间/h
图 5 酶解时间对抗原含量的影响
Fig.5 The effect of enzymolysis time
因素
A
B
C
1
1
1
1
2
2
1
3
3
2
1
2
2
2
3
2
3
1
3
1
3
3
2
1
3
3
2
195.9
195.0
120.0
432.0
425.0
176.0
156.0
164.0
428.0
65.3
65.0
60.0
144.0
141.67
58.67
52
54.67
142.67
92.0
87.0
84.0
D 1 2 3 3 1 2 2 3 1 561 110.0 113.0 187.0 36.67 37.67 150.3
23000
25000
图 4 加酶量对抗原含量的影响 Fig.4 The effect of enzyme dosage on antigenic content
由图 4 可知，抗原含量随酶量的增大而减少， 当加酶量>22 000 U/100 mL 时， 酶解率增加不明 显。 考虑到生产成本问题， 加酶量 22 000 U/100 mL 较为合适。 3.5 酶解时间
的活力； 2）蛋白质含量的测定：采用 GB/T 5009.5-03
食品中蛋白质的测定； 3）水解度的测定：采用三硝基苯磺酸钠（TNBS）
法[3-4]； 4）过敏原含量测定：采用 β-乳球蛋白试剂盒
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测定，属于酶联免疫法；
2.2.4 加酶量的选择 乳清蛋白溶液的质量分数
摘要 为了降低乳清蛋白粉（whey powder，WP）中主要过敏原— ——β-乳球蛋白的含量，采用碱性酶对乳清蛋白 粉进行水解。 结果表明：乳清蛋白粉经 80 ℃、30 min 的预处理，水解度有较大的提高，其抗原含量明显降低。 最 佳 酶 解 条 件 是 ： 酶 解 温 度 60 ℃、pH 9.0、 加 酶 量 19 000 U/100 mL、 酶 解 时 间 4 h。 制 得 的 水 解 液 的 水 解 度 达 16.0%，抗原残留量为原料的 5%。 酶解产物中的多肽可作为后续功能性产品的原料。