羧甲基纤维素酶测定原理

纤维素酶活力的测定

一、目的

学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。

二、原理

纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

（1）纤维素酶制剂 500mg

（2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4

（3）脱脂棉花 50mg / 份× 4

（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg

（5）水杨酸苷 500mg

2．主要仪器

（1）722 型或其他型号的可见分光光度计

（2）恒温水浴2 台

（3）沸水浴锅

（4）电炉子

（5）剪刀

（6）万分之一分析天平

（7）恒温干燥箱

（8）冰箱

（9）试管架

（10）胶头滴管

（11）具塞刻度试管20mL×24

（12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7

（13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3

（14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1

（15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1

3．试剂（均为分析纯）

（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液

将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液

准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。