貉铜蓝蛋白基因的克隆与序列分析

运 出系统 ， 完成细胞 内铁 的流出 ， 如果其 功能丧失 ， 则铁 不能
由肠细胞 内被转运到血浆 中， 进而影 响了动物肠道对铁 的吸
收 利 用 ， 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 试 验 动 物 ．
表 １ 貉 铜 蓝 蛋 白基 因 引 物
貉 子（ 毛期 ） 由哈尔滨某 毛皮 动物饲养场提供。 冬 ，
一
１４ ４ 反转 录合成第一链 ｃ Ｎ ．． Ｄ Ａ 在 １５ｍＬＥ ． ｐ管 中加入总
Ｒ Ａ５ Ｌ ｏ ｇ Ｔ ８１ Ｌ Ｈ ０ （ 含 Ｒ ａｅ ）１Ｉ ，０℃ Ｎ ，ｌ ｏ １ ， ２ 不 ｉ ｄ Ｎｓ 酶 Ｌ７ ｘ
Ｔ载 体 （ 连 Ｔ Ｋ Ｒ 大 ａ ａ ａ公 司 ） Ｍａｋｒ Ｄ ２ ０ 、 Ｌ ５０ ） ； ｒｅ （ Ｌ０ ０ Ｄ １０ ０
侯 志军等 ： 貉铜蓝蛋 白基 因的克隆与序列分 析
９ ５℃ ５ｍｎ ９ ｉ ，２ ８℃ １ｒｎ ７ Ｃ ２ｍｎ ３ ｉ；４ｏ １ｍ ｎ５ ． Ｃ ｉ；２ｏ ｉ，０个循 ａ
环： 后 ７ 最 ２℃ １ ｉ。 ０ｍｎ
一 ３ ３—
１４ ６ Ｐ Ｒ产物 的电泳 、 ．． Ｃ 克隆和序列测定
（ 大连 Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ公 司 ） Ｒ Ａ 保存 液 （ ａ ｐｅｐｏ ｃ ｒ 大连 ；Ｎ ｓｍ ｌ ｒ ｅｔ ）（ ｔ ｏ Ｔ Ｋ Ｒ 公 司 ） Ｄ Ａ片段纯 化 回收试剂 盒 （ ａａ ａ ；Ｎ 大连 Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ公 司 ）Ｄ ５ ； Ｈ ａ菌株 （ 由笔者 所在实验 室保 存 ） 质粒提取试 剂盒 ；
ｗｔ ｓｅｔ ｌ ｘｄｓ ｃ ｖｙ Ｊ ．Ａｄａｃｓｉ ｎｙ ｏｏｙａｄ Ｒ — ｉ ｅｓｎｉ ｉａｅａｔ ｉ ［］ ｈ ａｏ ｉｔ ｖｎ ｅ Ｅ ｚｍ ｌ ｅ ｎ ｇｎ
ｌｅ ｕｊｃｓ ｆｂｏｈ ｍ ｓｙ １７ ，４：８ ２ ６ ａ ｄｓｂｅｔ ｏ ｉ ｅ ｉ ｒ，９ ６ ４ １７— ３ ． ｔ ｃ ｔ
用 ２ 琼脂糖凝 ％
胶电泳鉴定 Ｐ Ｒ扩增产物 ， Ｃ 用凝 胶试剂盒 回收 Ｐ Ｒ产物 ， Ｃ 克
隆 到 ｐ ８一Ｔ载 体 中 ， Ｐ Ｒ鉴 定 的 阳 性 重 组 质 粒 ， 托 ＭＤ １ 经 Ｃ 委
上海 Ｉｖ ｒｇｎ 司进行测序 。 ｎｉｏｅ 公 ｔ
２ 结 果 与 分 析
２ １ 貉 铜 蓝 蛋 白 ｅ Ｎ 扩 增 ． Ｄ Ａ
（ 东北林业大学野生动物资源学 院， 黑龙江哈尔滨 １０ ４ ） ５０ ０
摘要 ：根据 哺乳动物铜蓝蛋 白蛋 白氨基酸 的保守序列 ， 考犬 的铜 蓝蛋 白基 因序列 ， 参 设计一对 特异性 引物 ， 采用 Ｒ Ｐ Ｒ技 术 ， Ｔ— Ｃ 从貉 的肝脏 中扩增 出一段长 ２ ３ｂ ２ ｐ的序列 。对其序列分析表明该基 因序列与 Ｇ ｎ ａｋ中已发表 的犬 ｅＢｎ 的铜蓝蛋 白基 因（ ｅＢ ｎ Ｇ ｎ ａ ｋ序列号 ： Ｍ 一 ３ ３ １ Ｘ ８ ０ ９ ， Ｍ一８０ ０ ） Ｘ ５４ ０ ， Ｍ一 ６７ ２ Ｘ ６ ８８ 同源性 为 １０ ， 实了貉亦存在铜 蓝蛋 ０％ 证
本试验 中貉铜蓝蛋 白基因的测序结果见图 ２ 。
２ ３ｂ ２
：
． ． ．．
…
． ． ．．
…
． ． ．．
…
． ． ．．
…
． ． ．．
６ｏ Ｔ ２Ｏ
．－ ：
ａｇ口ｃｃａ七ｃｔｏｔｃｃｔ口ｏｔｏｏｃａｃｃａｔｏｇｇ＊＊ｃｔｃａｃｏａａ口ｃｏ口ｏｔｇｏ＊ｏａａ口ｔａｃｔｔｃｃａ口
展 ．２ ０ ，９（２ ：９６—１８ ． ０ ７ １ １ ） １８ ９ ９
肝 细胞 和网状 内皮细胞 中铁浓度 显著增 高 ， 中铁蛋 白浓度 血
增 高、 铁离子浓度下降 ， 多数 患者有轻度贫 血 一 大 。侯 志军 等报 道 ， 白鼻 子病贫 血症可 能为 非食源 性缺铁 性贫血 。 貉 貉铜蓝蛋 白基因序列 的获得 ， 为研究 貉铜蓝 蛋 白在铁 代谢 中
Ｔ ８Ｏ ２２３
图２ 貉铜蓝 蛋白基因的测序 结果
３ 结 论 与 讨 论
［ ］ 重庆 ： 大学 ， １ ． Ｄ． 西南 ２ ０ ０ ［ ］ ｒ ｄ ｎＥ Ｈ ｉ ．Ｃ ｒ ｏ ｌ ｍ ｎ ｔ ｏｐｒ ｒ ｓｏ ｒ ｅ ２ Ｆｉ ｅ ， ｓ ｈ Ｈ Ｓ ｅ ｌ ａ ｉ： ｅｃｐ ｅ ｔ ｎｐ ｒ Ｐｏ ｉ ｅ ｅ ｕ ｐｓ ｈ ａ ｔ ｔｎ
Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ扩 增 产物 进 行 ２ 琼 脂糖 凝 胶 电泳 后 ， Ｃ ％ 在约 ２ ３ｂ 位置可见到清晰的 目的条带 （ １ 。 ２ ｐ 图 ）
２ ２ 貉 Ｃ ｐ ｒｐａｉ ｎｃ Ｎ 测序 与 分析 ． ｅ ｕｏｌｓ Ｄ Ａ ｍｉ
泳道１ 代表铜蓝蛋 【基 因 ；泳道 ２ ￡ ＝ ＝ Ｉ 代表 阴 性 对照 ； 泳道Ｍ代表Ｄ Ａ Ｎ 分子量ｍ ｒｅ （ Ｌ ０ ０ ａ ｒ Ｄ ２０ ） ｋ 图 １ 铜蓝蛋白基因的Ｐ Ｐ 产物琼脂糖 电泳图 Ｒ— ＣＲ
增 。 在 Ｐ Ｒ管 中 依次 加 入 １ Ｂ ｆ ｒ ． Ｌ ｄ Ｔ ｔ 、 Ｃ ０× ｕｆ ５ｔ 、Ｎ Ｐ１ ｘ 上 ｅ２ ｘ Ｌ
基金项 目： 中央高校基本科研业务费专项 （ 编号 ： Ｌ １ Ａ ７ ； Ｄ １Ｂ ０ ） 黑龙江
省教育厅科学技术研究项 目（ 编号 ：２ ２０ ２ 。 １５３ ２ ）
作者简介 ： 志军（ ９７ ） 男 ， 侯 １７ 一 ， 内蒙古卓资人 ， 博士 ， ， 讲师 主要从事
野生动物疾病 防治的工作 。 通信作者 ： 华育平。Ｅ—ｍａ ：ｕ ｉｇｈ ａ ２ ．ｏ ｉ ｙｐｎ＿ ｕ ＠１６ ｃｍ。 ｌ
下游引物 （ ０ ｐ ｏ ｐ ） １ Ｌ Ｔ ｑ酶 （ １ Ｌ 模 板 ２ ｍ ｌ ， 各 、 ａ ／Ｌ ５ ｕ） 、 （Ｄ Ａ １ｐ ， Ｄ Ｐ ｃ Ｎ ） ． 用 Ｅ Ｃ灭菌水加到 ２ Ｌ Ｃ Ｌ ５ ｊ 。Ｐ Ｒ扩增条件为 ｘ
离子氧化为三价铁离子 ， 帮助铁与转铁蛋 白（ｒｎｆｒｎ 相 结 ｔ ｓ ｒ） ａ ｅｉ 合（ 只有 三价铁离子可与转铁 蛋 白结合） 转出肠细胞后运输 ，
到肝脏 ］ 。铜蓝蛋 白通过 耦合转 铁蛋 白作用 于铁代 谢 的铁
序列 ， 参考犬铜蓝 蛋 白 ｍ Ｎ Ｒ Ａ序列 ， 设计 貉铜 蓝蛋 白基 因的
驼等动物中发现 了铜 蓝蛋 白的存在 。铜蓝蛋 白的分 子有
特殊的三角塔状结构 ， 的顶端和底部表面平坦 ， 塔 四周可与各 种底物及反应物直接接 触 ， 对氧化 Ｆ“ 、 香二胺 、 茶酚 、 ｅ 芳 儿 氨基酚等化合物具有氧化酶活性 。动物通过十二指肠 吸 收外 源性铁 ， 铁到 达肠细胞 内之后 ， 一部 分被储存 于铁蛋 白 （ｅｒｉ） 另外 一 部分 在 铜蓝 蛋 白和膜 铁转 运 辅助 蛋 白 ｆｒｔ 中， ｉｎ （ ｐ 的协同作用下 ， Ｈ） 通过膜铁转运蛋 白（ｅｒ ｏｔ ） ｆｒ ｐ ｒｎ 转运 ， ｏ ｉ 穿 过基侧膜运送到血浆 中。在此过程 中， 蓝蛋 白催化二 价铁 铜
本试验成功克 隆了一 段貉铜 蓝蛋 白基 因 ， 实 了貉 亦存 证 在铜蓝蛋 白基 因。铜蓝 蛋 白作 为一个重 要的亚铁 氧化酶 ， 他 在 机体 铁转 运和铁平衡 中起着 重要 ， 无铜蓝蛋 白血症 患者在
［ ］ 雪松 ， ３孙 何庆瑜 ． 含铁 蛋 白介 导的铁 转运分 子机 制 ［ ］ Ｊ ．化学 进
（ 上海华舜生物工程有 限公司） 。
１ ３ 主 要 仪 器 ．
低温 台式高速离心机 （ Ｅ ＭＬ ２２ ； Ｙ Ｈ Ｒ Ｅ Ｚ ３ Ｋ） Ｄ Ｙ一Ⅲ 一８ Ｂ
稳压稳流型电泳仪 （ 北京市六一仪器厂 ） Ｄ Ｙ一Ⅲ型 电泳槽 ；Ｙ （ 北京市六一仪器 厂 ） 可调式 取液器 （ ｈｒ ｏ ； ； Ｔ ｅｍ ） 仪表恒 温水 浴锅 （ 北京金北德 工贸有限公 司） 空气 浴震荡器 （ 尔滨东 ； 哈 联 电子有限公 司 Ｈ Ｑ—Ｃ型 ） Ｔ ６ ０型 Ｐ Ｒ仪 （日本 Ｔ Ｋ — Ｚ ；Ｐ ０ Ｃ ａａ
水浴 １ ｉ， 速在冰上 急冷 ２ｍｎ 离心数秒 ， ０ｍｎ 迅 ｉ， 使模板 Ｒ Ａ Ｎ 和引物的变性液集于 Ｅ 管底部 ； １５ｍ ｐ管中加入模板 ｐ 在 ． ＬＥ
（ Ｎ ／ ｌ ） Ｌ ５×Ｍ —ＭＬ ｕｆｒ Ｌ ｄ Ｔ Ｒ Ａ￣物 ７ ， Ｖ Ｂ ｆ ｔ ， Ｎ Ｐ混 合 物 ｅ２ｘ
１ Ｌ Ｒ ａｅ抑 制剂 ０ ５ ｍ ， Ｎ ｓ —ＭＬ Ｒ ａｅＨ一 ，Ｎｓ ． Ｌ Ｒ ａｅＭ Ｖ（ Ｎ ｓ ）
收稿 日期 ：０２— ２— ２ ２ １ ０ ０
０ ５ｍ ，２ｏ 保温 １ｈ ７ Ｃ保温 １ ｉ ． Ｌ ４ Ｃ ，０ ｏ ５ｍ ｎ后冰上 冷却 ， 得到 ｃＮ Ｄ Ａ溶液用于 Ｐ Ｒ扩增 。 Ｃ １４ ５ Ｐ Ｒ扩增 ．． Ｃ 按照常规方法在 Ｔ ６ ０Ｐ Ｒ仪内进行扩 Ｐ ０ Ｃ
一
３ ２一
江苏农业科学
２１ ０ ２年第 ４ ０卷第 ９期
侯 志军 ， 曾祥伟 ， 柴洪亮， 等．貉铜蓝蛋 白基因的克隆与序列分析［ ］ Ｊ ．江苏农业科学， １ ， （ ） ３ — ３ ２ ２ ４ ９ ： ３ 分析
侯 志军 ，曾祥 伟 ，柴洪亮 ，邢 明伟 ， 孙 颖 ，张 长生 ，华 育平
Ｒ 公司 ）凝 胶成像分析系统（ 国伯乐公司） ａ ； 美 。
１４ ． 方 法
１４ １ 样品 的采集 ．． 保存 。 １４ ２ 引物的设计 ．． 特异性引物（ １ 。 表 ）
采集 ２０ｍ ０ ｇ左右貉的肝脏放人事先装
入 了约 １ｍ Ｎ 保 存 液 的 Ｅ ＬＲ Ａ ｐ管 中 ， 盒 暂 存 ，一８ ℃ 冰 ０ 根据哺乳 动物铜蓝蛋 白氨基酸 的保 守
经 Ｄ Ａ序列测定 ， Ｎ 所获 得 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列长 度为 ２ ３ｂ ， ２ ｐ 与 Ｇ ｎ ａｋ中犬 的铜 蓝 蛋 白 基 因 （ ｅＢ ｎ 序 列 号 ： Ｍ 一 ｅＢｎ Ｇ ｎａｋ Ｘ
啊 ■ ｄ Ｉ ＾Ｉ
…
５４ ０ ， Ｍ 一８０ ９ ， Ｍ 一８ ０ ０ ）比较 ， 源 性 为 １０ 。 ３３１Ｘ ６７ ２ Ｘ ６８ ８ 同 ０％
１ ２ 试 剂 ．
１４ ３ 貉肝脏总 Ｒ Ａ的提取 ．． Ｎ 使用说 明提取貉肝脏总 Ｒ Ａ。 Ｎ
按 照 Ｔｉ ｌ Ｎ ｒ ｏ Ｒ Ａ提取试剂盒 ｚ
Ｔｉ ｌ Ｎ ｒ ｏ Ｒ Ａ提 取试 剂盒 （ 国 Ｉｖ ｒｇｎ公 司 ） 反转 录 ｚ 美 ｎｉｏｅ ｔ ； 酶 、ａ 酶 、 Ｎ Ｔ ｑ Ｒ Ａ酶抑制剂 ｄ Ｔ （ Ｎ Ｐ 大连 Ｔ Ｋ Ｒ 公司） ｐ ８ ａａａ ；ＭＤ１
口ｔｃｏ９￣ｏ９＇ａｃｏｃｏ ｏｃａｔａｔｔ口口ｏｔ口ｃｃａ口ｃｃｏａｇｏ七ｃｏｃａ口七ｃｃｔｇｇｔ口ａｇ口ａａ口ａ七０
ｇｃｏｏ＊ｔ口ｔ口ｔｇｏ￣ｃｏｇ９ｏ＊七七ａｃｃｏｔｔｃ，ｃｏｃｏ＊ｔ口ｏｔｑｃｑｃｃ口ａｏｏｇａｔｏｔ七ｑｃｃｔｃ口ｑ
口 ｃ ｃ ｔ ｇ ｏ ￣ ｔ ａ ｔ 口 ｃ ｇ Ｏ ０ Ｏ ｇ ０ Ｃ ＊ 口 ａ ｔ ａ ｃ ｇ ｃ ＊ ｔ ａ ｏ ｔ ｔ ｔ ９ Ｏ Ｏ Ｏｔ ￣ Ｃ ｇ ｑ
白基 因且高度保守 。
关键词 ： ； 貉 铜蓝蛋 白； 因；克隆 ； 基 碱基序列
中图分类号 ：Ｑ ８ ７ 文献标 志码 ：Ａ 文章 编号 ：０２— ３ ２ ２ １ ）９— ０ ２— ２ １０ １０ （０ ２ ０ ０ ３ ０
铜蓝蛋 白（ Ｃ ． ６ ３ 是 Ｈ ｌ ｂｒ Ｌ ｕｅ 于 １４ Ｅ １１． ） ｏｍ ｅｇ和 ａｒｌ ｌ ９ ８年 从人血清 一 球蛋 白中分离纯化出 的一种蓝色 的蛋 白质 ， 因 其外观呈蓝色 ， 所以 Ｈ ｌｂ ｒ 将之称 为铜 蓝蛋 白（ ｅ ｌ ｌｓ ｏ ｅｇ ｍ ｃｒ ｏ ａ－ ｕｐ ｍｎＣ ） ｉ， ｐ 。随后人类相继在猪 、 、 小 鼠、 、 、 兔 、 蛙 犬、 鸡 鹅 牛、 骆