第二十五章 克隆动物培育技术

（3）端粒
在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质上的 获得性修饰。 牛成纤维细胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干 细胞样细胞的端粒酶活性显著降低；用血清饥饿 法进行细胞传代，与不经处理的早期传代细胞相 比，端粒酶活性降低30%-50%。 体外培养牛胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞样细胞 晚期传代中发现了端粒缩短。
1952年，美国科学家Briggs和King以美洲豹蛙做核 年 美国科学家 和 以美洲豹蛙做核 移植实验。 移植实验。将未分化的蛙囊胚细胞的细胞核移植到蛙 去核受精卵中，获得了正常发育的蝌蚪。 去核受精卵中，获得了正常发育的蝌蚪。
后来的实验得出结论： 后来的实验得出结论：蛙胚胎细胞核的发育潜能随着 胚胎发育的进程、细胞分化的提高而逐步下降。 胚胎发育的进程、细胞分化的提高而逐步下降。
3、细胞周期
细胞周期分四个时期，包括G1期，S期，G2期， M期。有丝分裂中，成熟促进因子（也叫M期促 进因子MPF ）调控细胞由间期向M期转变。 核受体一般是MⅡ期卵母细胞，但是MⅡ期卵母 M M 细胞MPF的含量依然很高，将诱导移植核发生一 系列的形态变化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染 色体凝集(PCC)。只能将G1期(二倍体)的核移入 未经活化的MⅡ期的卵母细胞的细胞质，才能获 得染色体倍体正常且能正常发育的重组胚胎。
2、细胞核的全能性
细胞核的全能性是指一个细胞核具有该物 种完整的遗传信息，在适当条件下能够发 育成一个完整个体的能力。 将分化的细胞的细胞核导入去核的卵细胞 或受精卵，发育成一个完整的个体（如体 细胞克隆动物），就是细胞核全能性。
（二）证明细胞全能性的研究事例 1、动物早期胚胎细胞的全能性
德国Virchow R. 论断“细胞来自细胞”。 Roux(1888) 用烧烫的针破坏蛙2细胞胚胎。 Driesch(1892)以海胆做实验。 Spemann（1901～1903） 用细发结扎蝾螈受精卵。
一、细胞发育的全能性
（一）全能性的概念
全能性(totipotency) 全能性(totipotency) 是指分裂球发育成 为完整胚胎的能力。 为完整胚胎的能力。包括细胞发育全能性 和细胞核发育全能性。 和细胞核发育全能性。
1、细胞的全能性
细胞分化能力的强弱称为发育潜能。 根据发育潜能可以将细胞分成全能性、多能性、 单能性细胞及终末分化细胞。 受精卵以及胚胎干细胞的发育具有全能性；多能 造血干细胞具有的发育潜能称为多能性 ；终末分 化细胞，如人的成熟红细胞 。 细胞全能性的基础在于所有细胞的细胞核包含一 个物种的全套染色体组，具有发育成一个完整个 体所需要的全部遗传物质。
⑵ 哺乳类的核移植实验
1997年，英国 Roslin研究所的Wilmut等用乳腺细 胞核移植培育克隆绵羊——“多莉 (Dolly)”。 Wilmut等采用6岁母羊（白面）怀孕3个月时的乳 腺细胞进行核移植。供体核在血清浓度从10％降 至0.5％的培养液中诱导至静止期，然后移入去核 卵母细胞，发育为桑椹胚和囊胚再移植到受体母 羊（黑面），结果产羔l头（白面） ，即著名的 “多莉”。 这是世界上首次用体细胞克隆获得的后代，划时 意义在于证明动物成体细胞核仍具有发育全能 代意义在于证明动物成体细胞核仍具有发育全能 性。
供体核重新编程的机理
具有全能性的细胞核是否具有重编程的能力， 主要取决于细胞质启动供体核重新编程的因 子。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化 和组蛋白乙酰化。 在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质 上的获得性修饰。与端粒酶活性降低、端粒 缩短有关 。
第二节 动物克隆技术方法
动物克隆技术方法可分为胚胎分割、胚胎 嵌合、细胞核移植、雌核或雄核发育等。 细胞核移植方法又分为胚胎细胞核移植、 胚胎干细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移 植和体细胞核移植等。
5、重构胚的培养和移植
一种是体外培养，在适当的培养条件下培 养到一定时期，然后进行胚胎移植。 另一种方法是采用中间受体培养，在核质 融合后，将重构胚用琼脂糖包埋，移入动 物的输卵管或子宫，发育到桑椹胚或囊胚 后，再重新移入假孕受体子宫。
6、重复克隆(连续核移植) 重复克隆(连续核移植)
如有必要，将核移植胚胎培养至桑椹胚或 囊胚后继续做核供体重复克隆，可以显著 提高克隆成活率。
体细胞核移植法培育克隆绵羊一多莉
二、供体核重新编程
1、受体细胞的来源 早期使用原核期的受精卵和2细胞胚胎。 1986年后采用去核的处在MⅡ期(第二 次分裂中期)的成熟卵母细胞作胞质受 体。
2、重构胚核质适应机理 （1） 核质互作
Gurdon（1966）研究发现，核在移植前转录 rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失 活；随着胚胎的发育，rRNA基因活性恢复，核仁 重现。表明卵细胞质对核活性有重构效应。 事实上，核重编程同核质间蛋白质交换有关。许 多细胞质因子，如组蛋白(去)、乙酰化酶、DNA 甲基化/去甲基化酶等进入核内；核内转录因子， 如异染色质蛋白、组蛋白H1等输出核外。
⑵ 哺乳类的核移植实验
(棕色 棕色) 棕色 (黑色 黑色) 黑色
ICR(白色 白色) 白色 ICR(白色 白色) 白色
1981年，瑞 士科学家 Illmensee 和美国科学 家Hoppe首 次报道哺乳 动物细胞核 移植获得成 功。
⑵ 哺乳类的核移植实验
1983年，McGrath和Solt结合显微技术与细 胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎与未受 精卵用病毒诱导融合的方法获得了后代 。 1996年，Campbell等采集9d龄的绵羊胚胎 进行传代培养，以培养液中血清浓度递减 的饥饿培养，诱导6-13代细胞进入静止期， 移入去核的卵母细胞，产下了克隆羊。这 是用已分化细胞系经诱导进入Go期核移植 产下的首例克隆羊。
4、核质融合及卵母细胞质的激活
核质融合的方法有： (1)病毒融合法 如将仙台病毒与供体核一起注 入去核的受精卵中，促进细胞融合。 (2)电融合法 将重构胚置于电场下，以电脉冲 促进融合。 (3)Honolulu技术 利用吸液管将遗传物质取出， 然后注入卵细胞中。以机械和化学激活方 式促使重构胚的融合。
第二十五章
动物克隆技术
克隆动物(clonal animal)是指人们采用动物克 克隆动物(clonal animal)是指人们采用动物克 隆技术得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完 全相同的动物。 全相同的动物。 1997年世界卫生组织解释克隆为遗传上同一 1997年世界卫生组织解释克隆为遗传上同一 的机体或细胞系( 的无性生殖。 的机体或细胞系(株)的无性生殖。 分子水平上的克隆是指DNA分子的复制。 分子水平上的克隆是指DNA分子的复制。 分子的复制 细胞水平上的克隆是指细胞或组织培养。 细胞水平上的克隆是指细胞或组织培养。 个体水平上的克隆是指动、植物的无性繁殖， 个体水平上的克隆是指动、植物的无性繁殖， 其中，动物克隆偏重于指细胞核移植。 其中，动物克隆偏重于指细胞核移植。
7、克隆动物的鉴定
克隆动物出生后，从形态、性别上和分子 生物学水平上鉴定，以确定所克隆的动物 在遗传上是否真的来源于供体细胞系。 分子生物学鉴定方法有PCR、Southern、 Northern等。
克隆绵羊——多莉（Dolly）的培育示意图
二、人工诱导雌核发育技术
技术关键：一是使精子的遗传物质失活且保持精 技术关键： 子激活卵子发育的能力； 子激活卵子发育的能力；二是诱导卵子二倍体形 成。 使精子遗传物质失活的办法一般是采用辐射处理 (如γ线、X射线、紫外线等 。 射线、 如 线 射线 紫外线等)。 诱导卵子二倍体形成的办法，一是在受精后不久 诱导卵子二倍体形成的办法， 抑制第二极体排出；二是在受精卵第一次卵裂时， 抑制第二极体排出；二是在受精卵第一次卵裂时， 抑制有丝分裂。可以用温度(冷休克或热休克 冷休克或热休克)、 抑制有丝分裂。可以用温度 冷休克或热休克 、 静水压和化学(秋水仙素 细胞松弛素B等 等方法 秋水仙素、 等方法。 静水压和化学 秋水仙素、细胞松弛素 等)等方法。
一、细胞核移植克隆技术
其基本技术环节除显微操作技术外， 其基本技术环节除显微操作技术外，主要包括 ： 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 供体细胞（核供体）的准备。 供体细胞（核供体）的准备。 受体细胞（细胞质受体）的准备。 受体细胞（细胞质受体）的准备。 核移植。 核移植。 核质融合及卵母细胞质的激活。 核质融合及卵母细胞质的激活。 重构胚的培养和移植。 重构胚的培养和移植。 重复克隆。 重复克隆。 克隆动物的鉴定。 克隆动物的鉴定。
第一节 动物克隆技术的 理论基础及发展简况
动物克隆技术的理论基础是动物细胞发育的 全能性。 全能性。 两方面突破： 两方面突破： ①动物细胞核都含有与生殖细胞相同的遗传 信息，因此具有发育的全能性。 信息，因此具有发育的全能性。 ②卵母细胞的细胞质中含有启动供体核重新 编程(reprogramming)的各种因子。 编程(reprogramming)的各种因子。已经分 的各种因子 化的细胞核重新回到未分化的起点，重新编 化的细胞核重新回到未分化的起点， 程形成重构胚并被激活。 程形成重构胚并被激活。
体细胞克隆猪图解
细胞核移植 技术进行动物 克隆的主要步 骤，包括供体 细胞的选择、 受体细胞的 去核、核移植、 胚胎融合、重 构胚胎移植， 以及连续核移 植等等。
1、供体细胞的准备
常用的供体细胞有3大类：早期胚胎细胞、 常用的供体细胞有 大类：早期胚胎细胞、胚胎干细胞 大类 和体细胞。核移植时可以将整个细胞作为供体， 和体细胞。核移植时可以将整个细胞作为供体，也可以 挑取细胞核或含有少量细胞质的细胞移植到受体中 供体细胞的准备方面， 供体细胞的准备方面，通常采用建立细胞系的办法 。 包括： 胚胎干细胞系的建立。 TNT4细胞系的建 包括：① 胚胎干细胞系的建立。② TNT4细胞系的建 立。 将供体细胞的细胞周期做同步法处理， 期的诱导。 将供体细胞的细胞周期做同步法处理，即G0期的诱导。 期的诱导 方法是： 内将培养液的血清浓度由10.0%降至 方法是：在5d内将培养液的血清浓度由 内将培养液的血清浓度由 降至 0.5%。 。
（2）核重Hale Waihona Puke Baidu程
核重编程的过程就是基因重新被激活的过程。 体细胞去分化过程伴随着与染色质相关的蛋白 (如连接组蛋白、转录因子)的重构、基因组甲 基化变化、组蛋白组装及核小体形成等。染色 质解聚对核重编程可能是必须的。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化和 组蛋白乙酰化。通过基因组甲基化来改变 DNA与蛋白质间的作用。
2、受体细胞的准备
受体细胞有3类：卵母细胞、原核期受精卵和2 细胞期胚胎细胞。 获得卵母细胞多采用活体超排的方法。 卵母细胞的去核目前多采用显微操作法，即在 显微镜下用外径为20m的微细玻璃管吸管吸 取细胞核。常用的去核方法有盲吸法、半卵法 和功能去核法等。
3、核移植
在显微操作仪下将供体细胞核移入受体细 胞中。根据供体移入到受体细胞的不同部 位，可以分为带下（透明带下）注射和细 胞质内注射。
1962年， 1962年， Gurdon 通过连续核移植， 将爪蟾蝌蚪已经 分化的肠上皮细 胞核移植到去核 的卵母细胞中， 获得了可育的成 熟个体。
1977年 1977年， Gurdon以一只 Gurdon以一只 白化爪蟾蝌蚪细 胞为供体，克隆 胞为供体， 到了30只白化非 到了30只白化非 洲爪蟾。 洲爪蟾。
Roux(1888)用烧烫的针破坏蛙 细 用烧烫的针破坏蛙2细 用烧烫的针破坏蛙 胞胚胎观察胚胎发育情况
2、已分化的动物细胞的全能性 ⑴ 两栖类的核移植实验
Spemann 蝾螈受精卵结扎实验
Spemann的蝾螈受精卵结扎实验 的蝾螈受精卵结扎实验(1938) 的蝾螈受精卵结扎实验 用头发将受精卵沿第一次卵裂面结扎成2个半球，使细 胞核留在其中的一个半球中，两半球之间留有一条小 缝隙，当有核的一侧发育到8细胞期时，另一侧还未开 始分裂；当有核的一侧发育到16细胞期时，一个细胞 核进入无核的一侧，此时将胚胎完全结扎；140 d后， 每一侧都发育成为一个完整的胚胎。