药物对映体HPLC分离测定研究新进展

药物对映体HPLC分离测定研究新进展彭清涛　胡文祥3　谭生建(国防科工委军事医药研究发展中心,北京100101) 手性是宇宙间普遍特征之一。

药物的手性对生理活性的影响近年来为人们关注。

许多药物对映体有不同的药动学和药效学,并且往往有药理作用的显著差异。

多数情况下,只有一种药物对映体有显著的药理活性,而另一种对映体活性较低或没有活性,甚至活性相反或导致毒副反应。

目前国际上临床用的1200多种化学药物中,有480种含手性因素,其中只有20%是单一对映体形式,其余80%是以外消旋体形式给药。

在考察血药浓度与临床疗效关系时,须分别对单个对映体进行研究测定。

此外,在研制含手性中心的新药过程中,也应分别评价单个对映体的效价、毒性及药动学性质。

基于此,美国国家食品与药品管理局(FDA)规定,今后凡研制有手性中心的药物,必须对其各个对映体进行测定和评价。

由于许多手性药物各对映体的生物活性有显著差别,所以某些药物须以纯异构体供药,可见对映体的制备分离十分必要。

为此,有必要发展快速、准确、灵敏、简便的药物对映体的拆分和测定方法。

经典的方法如分级结晶、旋光法等的重现性或灵敏度欠佳。

随着手性高效液相色谱(HPLC)的发展,为解决上述问题提供了有效的手段。

从80年代初开始利用HPLC对药物对映体进行拆分和测定至今,进展十分迅速,文献增长量极大,成为新药研究和分析化学的前沿领域之一。

HPLC分离药物对映体的方法主要分为间接法和直接法。

前者又称手性试剂衍生化法(CDR),后者又可分为手性固定相法(CSP)和收稿日期　19972072213联系人手性流动相添加剂法(CMPA)。

两者的共同特点是均以现代HPLC技术为基础,并引入不对称中心(或光活性分子);不同的是CDR法是将其引入分子(溶质)内,而CSP和CMPA则引入分子间。

引入手性环境使药物对映体间呈现物理特征的差异是其HPLC拆分的基础。

本文在吕湘林等综述[1]的基础上,进一步系统评述了近年来利用HPLC分离测定药物对映体的研究新进展。

1　间接法间接法是药物对映体在用HPLC分离前,先与有高光学纯度的手性衍生化试剂(CDA)反应,形成非对映异构体,再以常规HPLC进行分离测定。

常用的衍生化试剂有测定胺类和醇类药物的氯甲酸酯,测定含羧基药物的22丁醇和薄荷醇,测定含酮基药物的(+)2三氟甲基苄基肼,测定含羟基药物的(-)2樟脑酰氯、(R, R)2O,O2二乙酰酒石酸酐,含氨基的手性药物通常采用异氰酸酯、异硫氰酸酯,测定氨基酸类药物可用邻苯二甲醛和N2乙酰2L半胱氨酸等。

目前许多CDA已经商品化,有一些CDA 还能用于药物对映体的制备和半制备。

国内目前在这方面也作了不少工作。

邵刚等[2]以52二甲氨基萘磺酰氯为柱前荧光标识试剂,用ODS柱完成了对静注l2麻黄碱和d2伪麻黄碱后豚鼠血浆内该对映体水平的考察,并且定量检测了服用中成药小青龙合剂后人血浆中的该对对映体。

金晓等[3]以(+)2FL EC 作为CDA,经过ODS Hypersil柱分离,以水和乙腈为流动相,使麻黄碱、去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱的4对对映体同时达到基线分离,分离度均大于115。

杨青等[4]用异氰酸222萘酯(N I)不仅拆分了胺类药物的对映体,也拆分了苯芴醇和苯丙醇的对映体。

丘宗荫等[5]用GITC及C18柱拆分了地佐西平对映体,该法已用于测定右旋地佐西平的光学纯度和血药浓度。

在体内手性药物的分析中,衍生化HPLC 常因其程序复杂而受到局限,Krull等发展了一种固相衍生化技术,可实现衍生化HPLC自动化。

这种固相衍生化试剂是将手性衍生化试剂固定于高分子材料的小孔内,小孔限制亲水的流动相及大分子蛋白质进入,而允许小分子疏水性药物进入发生衍生化反应。

同时在流动相中加入低浓度乙腈溶液和十二烷基磺酸钠(SDS)表面活性剂,其中SDS用于溶解变性蛋白并防止其沉淀在衍生化柱中,除蛋白外的小分子疏水性药物在聚合试剂孔内被衍生化,衍生化后的非对映体可以常规反相柱分离。

将这种固相衍生化柱与反相柱在线相连,即可直接进行对映体分析,Chou等用92芴基甲氧氯甲酸酯(FMOC)2L2脯氨酸和FMOC2L2苯丙氨酸标记物在活化的邻2硝基苯并苯酚聚合介质中合成有光学活性的聚合试剂,成功地分离分析了胺类对映体。

G ao等用FMOC2L2脯氨酰标记的固相衍生化试剂测定了尿中苯丙胺对映体。

其他手性胺类药物如普奈洛尔、阿普洛尔、麻黄碱、昔奈福林等采用固相衍生化法进行分析也见报道。

近年,用带FMOC2L2脯氨酰标记和邻硝基二苯甲酮为底物的手性固相衍生化试剂已用于血浆样品中药物对映体的直接进样分析。

以聚合羟基苯并三唑或二甲氨基吡啶　为底物的衍生化试剂,由于聚合基质的疏水性保护而稳定化,有较好的在线衍生化重现性。

衍生化试剂固定在聚合的载体上进行生物体液的分析有许多优点:聚合试剂的疏水特性在药物检测中可作为一种固相萃取的介体;聚合试剂的有限孔径同样起到限制性通道介体的作用,从而避免生物体液中高分子蛋白的干扰。

此法能直接分离分析体液中的药物对映体,简化了衍生化步骤,提供一种生物体液药物对映体检测的新途径。

间接法的主要优点为:(1)可用价格便宜、柱效较高的非手性柱;(2)反应时可通过选择衍生化剂提高检测灵敏度。

其缺点为:(1)衍生化反应使样品分离时间延长、操作较复杂;(2)对衍生化剂的纯度、稳定性要求较高;(3)还要求对映体的衍生化反应须迅速且反应速率一致。

2　直接法直接法是引入“手性识别”或“手性环境”(手性固定相、手性流动相添加剂)到HPLC系统中,以形成暂时非对映异构体复合物,从而使药物对映体分离。

这基于“三点作用”分离理论。

本文对于其手性识别机理不再赘述。

2.1　手性固定相(CSP)　手性固定相是在色谱柱的担体上加入高光学纯的手性异构体制作而成。

CSP使用方便,一般不需要高光学纯的衍生化试剂,制备分离便利,但也存在通用性差、样品有时须作柱前衍生等不足。

自1981年Pirkle研究出(R)2N2(3,52二硝苄基)苯基甘氨酸CSP以来,以商品出售的手性固定相已有100种左右。

这些手性固定相有Pirkle型相、蛋白质键合相、环糊精键合相、纤维素及多糖衍生物相、合成手性聚合物相、冠醚类键合相以及其他一些手性固定相等。

2.1.1　Pirkle型手性固定相　Pirkle型手性固定相的合成主要通过含末端羧基或异氰酸酯基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应,分别形成含酰胺或脲型结构CSP。

将2,2,22三氟(2 1292蒽)乙醇(TFAE)键合到硅胶上形成的固定相被称为第一代Pirkle型CSP。

其后,Pirkle 等又制备了一系列3,52二硝基苯甲酰(DNB)氨基酸、醇、胺衍生物CSP,构成了第二代Pirkle型CSP。

第三代Pirkle型CSP有富电子的萘基和较长的键合烷基链,提高了立体识别能力和适用范围。

此后,合成出既含π2酸(DNB),又含π2碱(萘基),含有碳、磷、联萘等不对称中心的CSP。

近几年来,又相继合成出氨基磷酸酯及一系列含萘、杂环的氨基酸衍生物、二氨和由联萘羧酸衍生的多种作用CSP。

Pirkle柱已商品化,其中一些可用于制备和半制备,在药物对映体分析中已广泛使用,已用于氨基醇类、乙内酰脲、内酰胺、胺类、醇类及硫醇类药物对映体的拆分。

Pirkle型CSP的优点是柱效和柱容量高,但在拆分有强酸或强碱性功能团的药物对映体时,要求进行衍生化。

最近,Petersen等[6]利用一种Pirkle型α2Burke 1手性柱(将二甲基2N23,52二硝基苯α2氨基酸2 2,22二甲基242戊基磷酸酯共价键合到5μm的巯苯基硅胶上)分离测定了15种β2阻断剂,分离度介于1107～1141。

Pirkle柱大多使用正相分离系统,流动相通常用己烷加少量醇类改性剂。

最近,Rustum发现Pirkle型手性相也可用于反相分离系统,从而扩展了其应用范围。

2.1.2　蛋白质手性固定相　蛋白质是一类由手性亚基团(L2氨基酸)组成的高分子量聚合物,可对药物对映体在蛋白质的结合位点进行手性识别而达到手性分离。

目前商品化的手性蛋白质键合相有两种:(1)将牛血清蛋白共价键合到硅胶上(Resolvsil柱),主要用于氨基酸及其衍生物对映体的分离;(2)通过离子键(或共价键)以及蛋白交联作用将α12酸性糖蛋白(α12 A GP)固定到硅胶上。

第二代蛋白质手性柱A GP柱(Chiral2A GP)较第一代的稳定性好、柱效高,且对许多药物对映体有良好的立体选择性,可直接分离许多药物对映体,如硫喷妥因[7]、心得怡及β2阻滞剂[8]等。

人血清蛋白(HSA)已通过二醇键合到硅胶上,对酸型药物和α2芳基丙酸非甾体消炎药有高对映体选择性。

A GP2CSP是当今血药研究中应用最广的CSP之一。

其后又研制出几种新的A GP2CSP,并用于酸性、碱性及中性药物对映体的分离。

近年来已研究出第三代的酸性蛋白手性柱Ovomucoid,其CSP是从鸡蛋白中分离出来的卵粘蛋白,在很宽的p H范围内有相当的稳定性,能分离许多不同的胺和羧酸类手性药物,如氯酚宁胺、苯异丙酸类。

酶也是一种蛋白质, Jadaud等研制了一种ACHT2CSP,将酶共价键合到硅胶上,已用于分离N2α2天冬酰2苯丙氨酸甲酯。

Haginaka等[9]认为,蛋白质由于外层亲水内层疏水,本身有混合功能,而过长的交联剂疏水键会使固定相的立体选择性降低。

他们用二琥珀酰亚氨基碳酸二酰胺(DSC)将卵类粘蛋白固定于氨丙基柱上,对体液中多种酸性、碱性手性药物进行实验,对映体分离良好。

Oda 等[10]将二琥珀酰亚氨基辛二酰胺(DSS)用作交联剂,将抗生物素蛋白键合于氨丙基柱上,对体液中的酮洛芬直接进样分析,两对映体分离良好。

使用蛋白质手性柱时,一般多用磷酸或硼酸缓冲液再加入0～5%的乙腈、乙醇、丙酮或醚类有机溶剂作流动相。

蛋白质手性柱的柱容量低,极易超负载,但用于制备也有报道。

这类手性柱很难将药物对映体母体与其代谢产物及内源性化合物分离,一般多需增加预柱或与非手性柱联用。

尽管如此,由于其特殊的对映体选择性,至今仍有许多药物只能在蛋白质CSP 上分离。

2.1.3　环糊精手性键合固定相　环糊精(CD)的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包容作用以及环外壳上的羟基与药物对映体分子发生氢键作用。

在3种类型的环糊精中,β2环糊精对形成包容络合物有最佳大小的内腔,适用于大多数药物对映体的位阻和电子特征,因此广为使用。

α2环糊精适合于分子量小于200的药物对映体的分析,而γ2环糊精则更适用于较大分子药物的分析,如含有稠环的药物。

Berthed[11]用商品β2CD柱和γ2CD柱拆分了25种不同类型的手性药物,其中有11种对映体间的RSΕ115。