第4章 PCR技术的应用

引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But …
引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result
引物设计的原则

引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)
具体因素

如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting
temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形 成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在 错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition）， 等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
72℃
5 min
备注：* 比两条引物的Tm值低5~10℃。
四、影响PCR因素
虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。
1. 引物
2. 变性温度和时间 3. 退火温度和时间
4. 延伸温度和时间
5. 循环次数
1、引物
引物决定了PCR产物的长度和特异性。 引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。
上游引物
5′
5′ 3′
3′
3′ 5′
它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。
为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18 bp。
3、DNA聚合酶
DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。
早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温
种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。
二、PCR基本原理
DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、 DNA连接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境 等多成份参与的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中 必需成分是 1. 模板DNA 2. DNA聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物搜索选项设定
引物类型
引物长度 搜索模式
5’引物位置范围
3’引物位置范围
产物大小范围
搜索结果
28对引物 每对引物的信息 引物分值 100分为满分
双击选中一对引物
回到主窗口
2、引物
引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引 物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。 通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而 3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。 下游引物
3′ 5′
1、模板DNA
模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基
因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒；
模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到 cDNA、质粒、病毒等； 每个反应中模板的量为1 ng～1 μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基 因组DNA的量应多一些。 PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致 PCR的非特异性扩增。
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该 频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo 设计引物时的3个标准


Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。
Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 ΔG 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
主要功能:
1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
Primer Premier 5.0使用介绍(1)
Load sequence
Preimer Premier 启动界面
基本信息
Sequence name Original sequence
下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。 目前商品化的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶最适工作温度为75-80℃。该酶具有5′→3′聚合酶活性，在镁离子存在情况
5′ 3′ 5′ 3′
双链模版 DNA 变性
3′ 5′ 3′ 5′
退火
上游引物
下游引物
3′ 5′
5′ 3′
5′ 3′
5′ 3′
延伸
5′ 3′ 5′ 3′
3′
5′ 3′
5′
多次循环
（2n 拷贝）
下面为一个典型的PCR循环参数设置：
94℃ 94℃ X ℃* 72℃ 5 min 30 s 30 s 1 kb/min 25-35个循环
2、变性温度和时间
在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNA完全变性成单链DNA，一般设为
95℃、5 min；在随后的循环中，可设为95℃、30s。
有些模板DNA的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间
会影响DNA聚合酶的活性。
3、退火温度和时间
退火温度与引物的Tm值相关，一般比Tm值低5~10℃。 退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合 而降低PCR效率。
行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。
2. 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引
物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。
3. 延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加 在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成与模版DNA互补的新DNA链。
Байду номын сангаас
较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容 易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引 发机率增加。
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在 错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基， 因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法
延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间 设置为30s基本上就足够了。
Tm值的计算 一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
4、延伸温度和时间
所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的最佳温度为70～
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物 的载体的相应序列而确定。
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件


Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
一般原则

引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x
109/412=200 )。而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个。
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Oligo 6.44 使用说明
主要功能：专门的引物设计软件
Oligo 6.44 启动界面
Open sequence file
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
五、PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表 现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现 在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设 计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
Choose a function Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面
First you can design the primer manually
下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。
4、脱氧核糖核酸
四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。 在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种 的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。
5、缓冲液
选中引物
上游引物
下游引物
只是示意图
引物分析

80度，所以延伸温度设为72℃即可。
在实践中Taq DNA聚合酶的延伸效率约为500 bp/30 s，若待扩增的片段较长，可
适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。
5、循环次数
在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，PCR产 物不再呈指数增加，此时称为平台效应。 循环次数设为25~30次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会 导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物 的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对 稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高 的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合 反应。（能值越高越容易结合）
PCR技术的应用
一、概述
PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成 酶和四种脱氧核糖 核酸进行DNA的体外合成反应。
PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获 得多达几百万拷贝的目的基因。

该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多
缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、TrisCl和MgCl2。
其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物
的解链温度。
三、PCR基本步骤
1. 变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用Taq DNA聚
合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进