小鼠小肠上皮内淋巴细胞的提取与抗原表型测定和功能的...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的提取与抗原表型测定和功能的初步研究①

周正任　叶晓卉　杨晓临　王　丹　(中国医科大学病原生物学教研室,沈阳110001)

中国图书分类号　R392112 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2001)0320135203

摘　要　目的:建立一种提取小肠上皮内淋巴细胞的方法,并对其功能进行初步研究。方法:采用机械分离法和Percoll 非连续密度梯度离心法提取小鼠小肠上皮内淋巴细胞,经间接荧光染色后用流式细胞仪检测表型。应用乳酸脱氢酶法检测其自然杀伤功能。结果:应用该法可获得小鼠小肠上皮内淋巴细胞2×106～4×106Π只鼠,活力测定>95%。抗原表型中7318%以上表达C D8分子,T CRγδ为4318%。而且自然杀伤活性明显高于小鼠脾淋巴细胞。结论:表明采用该法提取小鼠小肠上皮内淋巴细胞有效。IE L具有自然杀伤活性。

关键词　小肠上皮内淋巴细胞　自然杀伤活性　抗原表型

Studies on isolation phonotype and natural cytotoxicity of murine intraepithelial lymphocytes

ZHOU Zheng2Ren,YE Xiao2Hui,Y ANG Xiao2Lin et al.China Medical Univer sity,Pathogenic Microbiology Department, Shenyang110001

Abstract　Objective:T o extract a method for is olating murine intraepithelial lymphocyte and analyze its main function.Methods:Murine intestinal intraepithelial lymphocyte was is olated by a mechanical technique and Percoll discontinous density gradient centrigugation.Its surface antigens were measured by using indirect immunoflurescence.Its natural killing activity was examined by LDH method.R esults:2×106～4×106iIE LsΠper m ouse were acquired by using this method,add its vitality>95%.O f phenotypic antigen,m ore than73.8%showed C D8+cell, T CRγδ43.8%.IE L’s natural killing activity was higher than P BMCs.Conclusion:This method is effective of is olating IE Ls.IE Ls has natural killing activity.

K ey w ords　Intraepithelial lymphocyte　Natural killing activity　Phonotype

小鼠小肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithe2 lial lym phocyte,iIE L)主要见于小肠粘膜绒毛上皮细胞之间,9512%位于上皮基底部,317%在上皮层, 111%在顶端。iIE L是一群异质性的淋巴细胞。它在位置、表型、功能等方面均与外周淋巴细胞具有独特性1。我们采用机械分离法和Percoll非连续密度梯度离心法提取iIE L,对其抗原表型进行鉴定,并对iIE L细胞的自然杀伤活性进行了初步研究。

1　材料与方法

111　实验动物和传代细胞株　正常BA LBΠc鼠,4～8w。普通环境下饲养。由中国医科大学实验动物部提供。Y AC21细胞株,即小鼠T淋巴瘤细胞株,由中国医科大学微生物学教研室传代保存。

112　抗体系列试剂

11211　McAb14522Cll抗CE3抗体(仓鼠抗小鼠);

①本文受辽宁省自然科学基金资助(962316)

作者简介:周正任,男,59岁,教授,硕士生导师,研究领域为医学微生态学和抗感染免疫。GK115抗C D4抗体(大鼠抗小鼠);T LB115抗C D8抗体(大鼠抗小鼠);H572597抗αβTCR抗体(仓鼠抗小鼠);3A10抗γδTCR抗体(仓鼠抗小鼠)。多克隆抗体:FITC标记抗仓鼠IgG;FITC标记抗大鼠IgG。以上由日本庆应大学免疫学教研室石川博通博士惠赠。

11212　淋巴细胞分离液　Ficoll2Urografin(比重11089)分离液的配制:甲液:9%Ficoll双蒸水液。乙液:3319%Urografin,取20ml60%Urografin加入双蒸水15138ml。Percoll连续密度梯度液的配制:Percoll 原液:比重(11130±01005),PH ARM ACI A,购自北京华美生物工程公司。Percoll储存液:Percoll原液与10倍体积浓缩的C MF按体积比为9∶1的比例混合,比重调至11123gΠml,此液为100%Percoll,4℃保存。Percoll工作液:在4℃条件下用含5%FCS的RPMI2 1640液稀释100%Percoll,按体积比分别制成45%和70%的Percoll。梯度的制备:取70%Percoll2ml充填在15ml离心管底部,再取45%Percoll2ml轻轻重层在70%Percoll之上,可分离3ml约含4×107个

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周正任等　小鼠小肠上皮内淋巴细胞的提取与抗原表型测定和功能的初步研究　第3期

细胞悬液。

113　iIE L细胞的制备

11311　小肠上皮层的解离2,3　取小鼠小肠,纵向剖开,用Hanks液漂洗。将小肠切成1cm左右的片段,加入15ml含2%FCS的RPMI21640液,置37℃水浴振荡30min,取出后再用力振荡15s静置片刻后待肠片下沉,收集所有液体。用150目钢网过滤2次后,收集滤液,准备纯化。

11312　iIE L的纯化　将上述滤液装入事先制好的尼龙毛柱中流过。尼龙毛柱的制备:尼龙毛(日本产)300mg,松散均匀地充填在20ml注射器内,尼龙毛柱高度约占注射器体积的3Π4,高压灭菌,使用前先用RPMI21640液50～60ml洗柱,将滤液连续过滤3次,用含5%FCS的RPMI21640液50ml洗柱,收集所有滤过的液体,浓缩制成2×107个Πml的单细胞悬液。将此单细胞悬液用500rΠmin离心5min以去除混杂的上皮细胞,再经45%和70%Percoll制成的梯度分离液离心600rΠmin,25℃20min,收取45%与70%界面层细胞,用含5%FCS的RPMI21640液洗3次,备用。取少量细胞悬液进行台盼蓝染色和镜检以观察活力且计数。

114　外周血单个核细胞(P BM L)和脾淋巴细胞(SP L)的制备　摘取小鼠脾脏放入盛有Hanks液的平皿中,在100目钢网上研磨,收得滤过的细胞悬液即为脾细胞。将脾细胞重层于比重为11089gΠml的Ficoll2Urografin之上,离心20min(2000rΠmin,4℃)收取界面层细胞,再用含5%FCS的RPMI21640液重新悬起细胞,备用。取少量细胞悬液进行台盼蓝染色以观察活力。

115　免疫荧光染色　将待测细胞悬液(iIE L、SP L)

用011%NaN

32P BS 调至浓度为1×107个Πml。各取

100μl细胞悬液分别与McAb按适当稀释度等体积混合,设阴性对照,以P BS代替McAb,置4℃作用45 min(每10min混合1次),洗细胞2次,吸弃上清,再加入相应的FITC标记的多克隆抗体,置4℃避光作用45min,洗细胞2次。染好的细胞加1%聚甲醛115mlΠtp,FC M检测。

116　自然杀伤活性的测定　乳酸脱氢酶(LDH)释放法4,5　采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法,靶细胞为Y ac21,效应细胞分别为iIE L和SP L,效靶比为50∶1,效靶作用时间为4h,上清液与LDH底物作用时间为1h,酶标检测仪测定490nm OD值,计算其自然杀伤活性。2　结果

211　iIE L效靶的分离和纯化　获得的iIE L细胞,经过连续3次的尼龙毛柱的分离滤过,可以去除大部分组织残渣和细胞团块形成单细胞悬液,再经Per2 coll的分离,每只鼠得到活的iIE L2×106～4×106,活力测定>95%。

212　iIE L的表型特征　从正常BA LBΠc小鼠小肠提取的iIE L,经FC M分析大约85%(8511±218)的iIE L 是C D

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+,74%(7318±2177)是C D

8

+,只有14%(1315

±213)的iIE L是C D

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+。C D

4

+与C D

8

+比值大约为012。αβTCR和γδTCR的表达:用FC M分析iIE L、SP L、P BM L三种不同来源的淋巴细胞中αβTCR和γδTCR的表达。结果:αβTCR和γδTCR细胞分别占iIE L的4016%和4318%,SP L中以αβTCR细胞为主, iIE L中γδTCR细胞的比例高于SP L的γδTCR细胞的比例(见图1)。

213　NK活性测定　选用普通环境条件下饲养的6周龄BA LBΠc鼠,首先用LDH法测定小肠iIE L和SP L的NK活性,SP L的细胞毒活性为2816%±217%(n=12)。iIE L的细胞毒活性为2519%±310%(n=12)。iIE L表现出比SP L高的NK活性(P<0105)。

3　讨论

近年来,外国学者建立了一些从小鼠小肠制备iIE L的方法6～8。由于肠粘膜淋巴细胞可以来自上皮层和固有层等不同组织部位,而且95%的iIE L分布在上皮基底部,上方为两个上皮细胞的紧密连接,下方为基底膜,因而为了制备数量大、纯度高的小肠iIE L需要考虑两方面的问题。一方面,为了完整体现iIE L的性质,应尽可能使上皮层完全解离以获得全部的iIE L;另一方面,要避免小肠内部其他细胞尤其是固有层淋巴细胞混入。我们参照Davies介绍的机械法2,在用振荡水浴孵育小肠片段的过程中,未使用磁力搅拌棒,也未加入酶和裂解剂。我们认为这样可以避免细胞的破损,有利于细胞功能活性的保持,同时有效地控制了固有层细胞的混入。

Percoll是一种新型的密度梯度离心分离液,用于iIE L的纯化效果优于Ficoll分离液。我们利用Percoll制成的双层密度梯度分离液除去了绝大多数与iIE L混杂在一起的其他细胞达到了纯化的目的。

有报道认为,iIE L中很少或完全没有B细胞的存在9。多次尼龙毛柱的滤过不会造成iIE L中T

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・中国免疫学杂志2001年第17卷