牛奶中酪蛋白的提取与分析

实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶

小组成员：

实验时间：

一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析

二：报告撰写者

三、小组成员

实验仪器

温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm ×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）、、、的移液管、试管、试管架、

四、实验材料

牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典）

五、实验试剂

特仑苏400ml、金典200ml、巴比妥（*）、巴比妥钠（*）、氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、L的乙酸100ml（*）、L的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*）所需试剂配制方法：

乙醇乙醚混合液的配制：

10ml95%的乙醇

10ml95%的乙醚

乙醇钠缓冲液的配制：

配制乙醇乙醚1:1的混

L 的乙酸51ml

L 的乙酸钠49ml

巴比妥钠缓冲液的配制：

巴比妥

巴比妥钠

染色液的配制：

氨基黑10B 50ml 甲醇AR

10ml 冰醋酸AR

漂洗液的配制：

45ml95%乙醇AR

5ml 冰醋酸AR

蒸馏水

透明液的配制：

25ml 的冰醋酸AR

75ml 的无水乙醇AR

L 氢氧化钠溶液的配制：

16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml

10%氢氧化钠溶液的配制：

5g 的氢氧化钠固体定容至50ml

双缩脲试剂的配制：

15mg 五水硫酸铜

配制巴比妥钠缓冲液（,./L ）,

将上

+40ml 蒸馏水，

混匀既得染

配制的乙酸钠缓冲液（l ） 混匀得染色液

混匀得透明液

溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，加入10%氢氧化钠溶液3ml ，用

60mg酒石酸钾钠

标准酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）：

用L氢氧化钠溶液配制10ml

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml）：

用L氢氧化钠溶液配制10ml

标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：

用L氢氧化钠溶液配制

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）：用L氢氧化钠溶液配制

七、实验目的

1.掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法

2.了解蛋白质分离纯化的基本办法

3.学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具

体操作

4.掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并

比较两种方法

5.熟悉分光光度计的原理和操作

6.比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量

八、实验原理

酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶解于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白中除去脂类杂质。

酪蛋白并不是单一的一种蛋白质，而是多种性质类似的蛋白质的统—，β—，γ—，κ—4种类型组成。它们各自的等电点称。其一般由α

s

（pI）具有一定的差异，本实验将酪蛋白溶液点样于用(高于酪蛋白各型等电点)缓冲液浸泡过的醋酸纤维膜上，并在该缓冲液体系中进行电泳，使酪蛋白分子上带上不同量的负电荷，在电泳过程中酪蛋白分子由负极向正极移动，同时酪蛋白各类型分子的相对分子量也不同，因此在电泳过程中其迁移率也不同，从而把酪蛋白的各种类型分离开来。

酪蛋白各组分的含量、等电点及大小

双缩脲在碱性溶液中能与二价铜离子产生紫红色络合物，该反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中因含有两个以上的肽键，因此也能发生双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子产生紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的含量称正比，与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故可用双缩脲反应来测定蛋白质的含量，测定范围为ml蛋白质。

由于蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等残基中具有共轭双键，使得蛋白质在280nm处具有最大吸收值，且其光吸收值与浓度在一定范围内

成正比，因此，该法可用作蛋白质定量测定。该法测定蛋白质含量时具有简单、灵敏、快速、不消耗样品、不受低浓度盐干扰等优点，但该法准确度较差，特别是如果样品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰，这时，就需要通过紫外吸收差来求蛋白质浓度，但也存在着一定的误差。

九、实验步骤

（一）酪蛋白的提取

1、酪蛋白的等电点沉淀

做六组平行试验，每组分别：将100ml的牛奶放到500ml的烧杯

中，加入40度左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达左右，用pH试纸

调试。将上述悬浊液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，

收集沉淀。

2、除去脂类杂质

将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此

悬浮液倾入布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚

混合液总洗涤沉淀两次，最后再乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉

淀从布氏漏斗中移去。在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到

的即为酪蛋白。准确称重。

（二）酪蛋白的分离与分析

3、醋酸纤维薄膜的准备（2张）

将醋酸纤维薄膜缓缓进入盛有巴比妥钠缓冲液的器皿中，全部润

湿10-30min，至膜上无白点存在。